【摘 要】
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目的:研究肺炎链球菌S.pn毒力蛋白自溶素LytA是否通过改变S.pn-DNA在宿主巨噬细胞胞质中的累积而影响巨噬细胞ISG化,进一步调节巨噬细胞的吞噬功能。背景:肺炎链球菌lyt A基因编码自溶酶LytA,该蛋白作用于细菌细胞壁肽聚糖使其水解,使稳定生长期的S.pn发生自我溶解死亡,并释放出多种胞内容物如Ply、S.pn-DNA等。研究表明,宿主细胞质中异常累积的DNA可通过DAI/STING/
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目的:研究肺炎链球菌S.pn毒力蛋白自溶素LytA是否通过改变S.pn-DNA在宿主巨噬细胞胞质中的累积而影响巨噬细胞ISG化,进一步调节巨噬细胞的吞噬功能。背景:肺炎链球菌lyt A基因编码自溶酶LytA,该蛋白作用于细菌细胞壁肽聚糖使其水解,使稳定生长期的S.pn发生自我溶解死亡,并释放出多种胞内容物如Ply、S.pn-DNA等。研究表明,宿主细胞质中异常累积的DNA可通过DAI/STING/IRF3信号通路介导IFN-Ⅰ及ISGs表达上调。其中表达上调最显著的ISG15是一种类泛素蛋白,已被证明在宿主对抗病毒、细菌和真菌感染中均具有重要作用。但是ISG15在S.pn感染过程中的调节作用,以及LytA对宿主细胞ISG化应答的影响尚不清楚。前期研究提示S.pn表达LytA缺失显著抑制S.pn-DNA的释放,后者可上调ISG15表达,故我们推测S.pn自溶素LytA可能会通过改变S.pn-DNA在宿主细胞质中的异常累积而影响IFN-Ⅰ免疫应答及其下游ISG15的表达,从而调控巨噬细胞对S.pn的吞噬功能。主要研究方法:1、培养RAW264.7细胞、PEMs细胞、A549细胞和MEF细胞,分为NC组、Lipo 2000处理组、S.pn D39感染组以及S.pn-DNA刺激组,通过q PCR和WB检测S.pn及S.pn-DNA是否能够诱导宿主细胞ISG15及ISG化水平上调。2、培养RAW264.7细胞,分为NC组、S.pn D39感染组以及S.pn D39Δlyt A感染组,通过q PCR和WB检测RAW264.7细胞ISG15和ISG化蛋白质的表达水平,来验证S.pn自溶素LytA影响巨噬细胞ISG化。3、培养RAW264.7巨噬细胞,分为NC组、S.pn D39感染组、S.pn D39Δlyt A感染组以及r LytA+S.pn D39Δlyt A刺激组,经免疫荧光染色后在激光扫描共聚焦显微镜下观察细胞质中异常DNA的累积情况,q PCR技术定量细胞质中S.pn基因组保守序列16S r DNA和gyr B的拷贝数,来验证S.pn自溶素LytA影响S.pn-DNA在巨噬细胞胞质中的累积。4、培养RAW264.7巨噬细胞,分为NC组、S.pn D39感染组、S.pn D39Δlyt A感染组以及r LytA+S.pn D39Δlyt A刺激组,通过吞噬杀伤实验检测巨噬细胞的功能,同时以q PCR技术测量炎性因子TNF-α和IL-1β的表达水平。主要研究结果:1、与NC组和Lipo 2000处理组相比,S.pn D39全菌和S.pn-DNA刺激可诱导RAW264.7细胞、PEMs细胞、A549细胞和MEF细胞中ISG15以及ISG化水平显著升高,且ISG15的表达水平对IFN-β呈剂量依赖性。2、与NC组和S.pn D39感染组相比,S.pn D39Δlyt A感染组RAW264.7细胞中ISG15以及ISG化蛋白质表达水平显著增高。3、S.pn D39Δlyt A感染组RAW264.7细胞胞质中S.pn-DNA异常累积较S.pn D39组显著增多,而当给予S.pn D39Δlyt A组RAW264.7细胞补充外源性r LytA蛋白则可抑制这种异常累积。4、与S.pn D39感染组相比,S.pn D39Δlyt A感染组RAW264.7细胞对细菌的吞噬能力增强而杀伤率降低,而补充外源性r LytA蛋白可抑制S.pn D39Δlyt A组RAW264.7细胞对细菌的吞噬杀伤功能。此外S.pn D39Δlyt A组RAW264.7细胞中炎性因子TNF-α和IL-1β的表达水平较S.pn D39感染组显著升高。结论:本研究首次证实肺炎链球菌S.pn重要的毒力蛋白自溶素LytA通过诱导S.pn自溶增加而减少巨噬细胞对S.pn的吞噬及细胞质内S.pn-DNA的异常累积,从而降低S.pn-DNA诱导ISG化应答水平;同时阐明S.pn表达LytA缺陷进一步显著上调由S.pn感染诱导的ISG15表达,进而导致炎性因子TNF-α和IL-1β的高表达,上调调控巨噬细胞对S.pn D39Δlyt A的吞噬功能,有助于促进宿主清除S.pn D39Δlyt A。这将有利于深入认识细菌自溶、细菌DNA释放等过程参与机体免疫应答的调控机制,为防治肺炎链球菌感染性疾病提供新的实验依据。
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