肿瘤的放疗是一把“双刃剑”,放射线具有杀灭肿瘤细胞的作用,这是放疗的主要目的,但是,肿瘤细胞在接受一定剂量照射后所产生的自由基会对正常组织细胞产生严重的损伤,这种对肿瘤细胞的杀伤作用以及对临近正常组织细胞的损伤作用同时存在,表现为即时性杀伤与周身延迟性损伤的差异,因此,自由基的杀伤与副作用损伤就构成了“同心圆作用”[1],并与“细胞旁观者效应”机制密切相关,影响整个放疗的进程和效果。放射诱导旁观者效应（radiation induced bystander effect,RIBE）是指未接受照射的细胞及旁观者细胞受到照射细胞影响出现诸如细胞死亡、基因突变、染色体不稳定等类似于直接受到照射的细胞出现的反应。旁观者细胞与放射细胞可相邻,也可不相邻。其发生的机制被认为与分泌可溶性扩散因子、氧化新陈代谢、细胞缝隙连接胞间通讯等有关,氧化新陈代谢是目前研究的热点问题。过氧化氢（H₂O₂）是放疗的重要产物,是活性氧（ROS）的重要组成部分,不同剂量的辐射与ROS的产生量呈线性关系。随着自由基生物学研究的发展,近年的研究发现:低浓度的自由基,特别是H₂O₂能够影响一系列信号转导途径。机体内的自由基可以通过其浓度调节机体细胞的生死平衡,除了引起细胞凋亡、坏死的功能,其更广泛的生理意义在于其对转录因子的激活以及对细胞增殖、分化的促进;另外临床观察不断有放疗后二次肿瘤发生的报道,研究者多把关注点集中在旁观者效应与细胞表观遗传化改变的关系上,而对于H₂O₂充当信号因子并通过旁观者效应机制扩散在机体中引起一系列生物学变化的研究还很少。我们认为H₂O₂在术后二次肿瘤的发生过程中起着重要的作用。本课题分为实验一和实验二两部分内容。“实验一”主要研究在高剂量的辐射诱导下受照射细胞通过旁观者效应对未接受照射细胞的损害,实验表明辐射诱导受照射细胞产生中、高浓度的ROS通过细胞氧化应激反应诱导细胞凋亡甚至导致其坏死。基于此设计本课题的实验二,初步探讨了低浓度H₂O₂对细胞增殖的影响以及与抗氧化酶谱之间的关系。本课题研究高效抗氧化剂对旁观者效应的干预作用,证明高效的抗氧化剂可以改善旁观者效应,此外,低剂量的辐射产生的低浓度H₂O₂以及外源性低浓度H₂O₂处理细胞对肿瘤细胞都有促进增殖的作用,提示该机制与临床放疗后二次肿瘤的发展相关,不同浓度H₂O₂对抗氧化酶谱的影响也不同,主要通过影响上游Nrf2核转录因子的表达来调节抗氧化酶谱的表达水平,以上结果对深入证明氧化新陈代谢机制以及指导临床放射治疗后的防护具有重要的意义。1、γ射线照射引起的“旁观者效应”及抗氧化剂的干预作用分别给予U2OS细胞0、0.25、1.00、3.00、4.00Gy ⁶⁰Co-γ射线照射,照射后收集细胞按1×10⁴的密度接种至96孔板,培养48小时,MTT法检测细胞活性;收集细胞用流式细胞仪DCFH-DA法检测细胞内活性氧的生成情况结果显示:0.25 Gy剂量照射细胞可以促进细胞的增殖,与其他各组相比具有显著性差异（P<0.05）,低剂量⁶⁰Co-γ射线照射后细胞内的活性氧（ROS）含量与阴性组相比升高,而1.00、3.00、4.00Gy ⁶⁰Co-γ射线照射细胞后（ROS）含量与阴性组相比升高更为显著（P<0.05）,并有剂量-效应关系。基于以上照射实验的结果,我们用3Gy⁶⁰Co-γ射线照射骨肉瘤U20S细胞,并将其与未经照射的骨肉瘤U20S细胞混合培养,观察引起未受照射肿瘤细胞的RIBE,同时设计了平行的Trolox细胞培养组,观察抗氧化剂Trolox的干预作用。结果:与阴性组细胞相比,未受照射细胞与受照射细胞共同培养后的细胞存活率下降（P<0.05）,细胞的活性降低（P<0.05）,细胞克隆集落形成率下降（P<0.05）,细胞微核率含量明显升高（P<0.05）,培养基中的MDA含量明显增高。经过Trolox干涉后,上述各项指标都有明显的改善。以上结果表明:骨肉瘤U20S细胞经过⁶⁰Co-γ射线照射后引起细胞明显损伤、氧化作用明显增强,而将照射后的细胞与正常细胞混合培养,观察到受照射的肿瘤细胞对未受照射细胞产生“旁观者细胞效应”,及未受照射细胞出现同样的氧化损伤。具有抗氧化作用的维生素E衍生物Trolox对旁观者效应细胞的氧化损伤具有显著的缓解作用。这个结果一方面进一步证明了ROS是辐射引起旁观者效应的主要活性介质,同时也表明抗氧化剂能够缓解这种旁观者效应。微核率是反应DNA突变的重要指标,Trolox对微核率的改善作用有限提示单一的抗氧化剂存在靶点的局限性。本实验为进一步探讨旁观者效应的机制以及利用抗氧化剂缓解临床放疗副作用提供了实验依据。2、低浓度H₂O₂对肿瘤细胞增殖的影响以及抗氧化酶谱的反应性在培养的骨肉瘤细胞U2OS中添加外源性H₂O₂进行干预对细胞增殖的影响的对比研究结果表明:1)外源性H₂O₂对促进细胞增殖与凋亡存在剂量依赖性。通过给予不同浓度外源性tBHP的方式培养细胞,用MTT法计算IC50以及测定细胞凋亡,用以区分tBHP对U2OS细胞的增殖作用浓度和毒作用浓度,筛选出增殖影响浓度,随后用tBHP处理细胞分为0（阴性实验组）、1.00、10.00、40.00、100.00μmol·L^-1组初步观察低浓度tBHP对U2OS细胞增殖以及凋亡的影响。结果:单纯添加外源性tBHP,1.00、10.00μmol·L^-1 H₂O₂对骨肉瘤细胞系U2OS的增殖和生长具有一定促进作用（P<0.05）,MTT法绘制细胞增殖曲线显示这种促进作用在加入H₂O₂ 4小时后最为明显,流式细胞仪检测的结果显示1.00、10.00μmol·L^-1 H₂O₂不会促使细胞的凋亡;而40、100μmol·L^-1浓度H₂O₂对细胞表现出毒性作用,表现为40μmol·L^-1 H₂O₂对细胞增殖的抑制,晚期凋亡细胞比例明显增高,凋亡相关因子Caspase-3与其他组相比表达增高（P<0.05）,100μmol·L^-1 H₂O₂诱导细胞死亡,死亡细胞率显著性增高（P<0.05）。2)外源性H₂O₂启动了抗氧化酶谱的应激性变化。测定各个浓度tBHP处理组细胞MDA水平的变化以及抗氧化酶的生物活性。利用RT-PCR、Western- Blot等技术比较系统的观察调节抗氧化酶系的关键因子Nrf2以及抗氧化酶CAT、SOD、GPX的mRNA与蛋白表达的变化,初步研究低浓度H₂O₂启动抗氧化酶谱的应激性变化。结果:①1.00、10.00μmol·L^-1浓度tBHP组,抗氧化酶的生物活性与阴性组相比表达降低或变化不显著;MDA含量低于阴性组,但是,40μmol·L^-1组MDA含量与1.00、10.00μmol·L^-1组相比,显著升高（P<0.05）。结果说明,细胞内MDA的形成和抗氧化酶谱的变化,与给与的H₂O₂剂量具有显著相关性,低水平的H₂O₂(1.00、10.00μmol·L^-1以下)没有造成细胞氧化应激,当H₂O₂超过一定浓度后,能够启动细胞内抗氧化酶系的调节机制。低剂量H₂O₂刺激细胞,抗氧化酶水平不升高,所显现的只是信号因子作用,当H₂O₂水平增加,细胞产生氧化应激,能够启动抗氧化酶谱应激性表达,表达上调发挥应激损伤的干预抑制作用。②抗氧化酶基因与蛋白水平的变化。各浓度组的抗氧化酶mRNA水平表达: Cu/Zn-SOD以及GPX1表达变化明显,不同浓度H₂O₂组之间表达出现明显差异,蛋白水平表达趋势与mRNA基本一致,40、100μmol·L^-1与1.00、10.00μmol·L^-1组相比蛋白水平表达上调（P<0.05）。③抗氧化核心上游调控因子Nrf2的变化。Nrf2被认为是抗氧化酶的调节因子,Western-blot测定显示:1.00、10.00μmol·L^-1组与阴性组相比表达略有下调,40、100μmol·L^-1组表达开始上调,其中以100μmol·L^-1组最高。以上结果说明低浓度的H₂O₂(1.00、10.00μmol·L^-1)可以促进肿瘤细胞的增殖,发挥信号因子的作用,也能被细胞的抗氧化系统有效清除,随着H₂O₂浓度的增高,Nrf2的表达增强,抗氧化酶Cu/Zn-SOD以及GPX1的表达也被调控性增强,说明一定浓度水平的H₂O₂通过启动Nrf2上调表达而对下游基因发挥着调节的作用。实验二以建立细胞模型为基础,从外源性添加H₂O₂处理细胞并结合实验一内低剂量辐射可以产生低剂量H₂O₂的结果,两方面探讨了低剂量的H₂O₂对肿瘤细胞增殖的影响,证明低剂量H₂O₂可以促进细胞的增殖,外源性低浓度的H₂O₂可能作为信号分子参与了细胞的增殖,且可以被细胞内的抗氧化酶清除从而避免细胞的氧化损伤,而外源性H₂O₂在高于一定浓度后表现为对细胞的氧化损伤,引起氧化应激发挥细胞毒作用,并且可能通过引起Nrf2的表达增高来调节抗氧化酶谱的表达,从而激活机体的抗氧化防御体系。放疗过程中不可避免的会有H₂O₂的产生,产生内源性的H₂O₂通过旁观者效应机制在非放射线照射的组织和细胞引起生物学效应,这种效应可能是对正常组织的造成氧化损伤也可能促进细胞的增殖,发挥损伤作用为主还是促进增殖与H₂O₂作用细胞的浓度相关,H₂O₂的浓度能够影响机体抗氧化酶的表达,其机制可能是通过反馈调节Nrf2来改变下游抗氧化酶的表达,同时启动机体抗氧化应激机制。本课题的研究的结果为探讨临床放疗后二次肿瘤的发生、发展机制提供新的思路。