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病毒感染性疾病严重威胁着人类的健康,开发新的抗病毒药物是治疗病毒性疾病的必由之路。本研究是在发现一株真菌代谢产物有广谱抗病毒活性的基础上,对产抗病毒活性物质的菌株进行诱变育种及发酵条件的研究。
[目的]
1对产抗病毒活性物质菌株进行诱变育种,获得高抗病毒活性的菌株;
2对产抗毒活性物质菌株的最适发酵条件进行研究。
[方法]
1 自然选育:将孢子悬液用0.85%的生理盐水做梯度稀释,分别选取适当稀释度菌悬液涂布马铃薯培养基平板,长出成熟菌落后,挑取单菌落,接种至马铃薯培养基斜面上。将挑取的单菌落进行液体发酵,菌丝体提取物做抑毒试验,计算抑毒指数,筛选高抗病毒活性的菌株。
2诱变育种
①紫外线诱变:把孢子悬液加入无菌平皿中,放在紫外灯下照射,然后在红光灯下进行梯度稀释,挑选适当的稀释度涂布平板。长出成熟菌落后,挑取单菌落进行液体发酵,菌丝体提取物做抑毒试验,计算抑毒指数,筛选高抗病毒活性的菌株。
②CO<60>诱变:取孢子悬液分装在螺旋口试管中,用不同剂量的Co<60>诱变,然后做梯度稀释,选取适当稀释度涂布平板,待长出成熟菌落后,统计致死率,并随机挑选单菌落进行液体发酵,菌丝体提取物做抑毒试验,同时计算抑毒指数。③硫酸二乙酯诱变:取制备好的孢子悬液10ml,加入1%硫酸二乙酯0.2ml,振荡一定时间后,加入25%硫代硫酸钠溶液终止反应。然后取诱变孢子悬液做梯度稀释,待长出成熟菌落后,统计致死率,并随机挑选单菌落进行液体发酵,菌丝体提取物做抑毒试验,同时计算抑毒指数。
④紫外+氯化锂复合诱变:吸取紫外线照射后的孢子悬液接种到含0.5%氯化锂的马铃薯培养基平板上,涂布平皿。至长出成熟菌落,同时统计致死率,并随机挑选单菌落进行液体发酵,菌丝体提取物做抑毒试验,同时计算抑毒指数。
3培养基及发酵条件优化①发酵培养基的正交试验:利用L<,9>(3<4>)正交表,对发酵培养基进行四因素三水平的正交试验。
②发酵条件的优化:以抑毒试验作为测活依据,对菌株发酵的最适周期、温度、摇床转速、培养基装量、起始pH及接种量进行优化研究。
[结果]
1自然选育:挑选自然选育的单菌落50株,经初筛、复筛没有筛选到比原菌株抑毒指数明显提高的菌株。
2诱变育种
①紫外线诱变:紫外线诱变得到的30株菌株,经初筛、复筛未筛到比原菌株抑毒指数明显提高的菌株。
②Co<60>诱变:初筛得到8株正突变菌株,复筛仅有2菌株具有高抑毒活性。
③硫酸二乙酯诱变:初筛得到5株正突变菌株,复筛仅有1菌株具有高抑毒活性。
④紫外线+氯化锂诱变:初筛得到9株正突变菌株,复筛仅有3菌株具有高抑毒活性。
3培养基及发酵条件优化①发酵培养基的正交试验:正交试验确定的培养基组成为A<,2>B<,3D<,2>,即马铃薯20%,蔗糖2.5%,MgSO<,4> 0.1%,KH<,2>PO<,4> 0.3%。
②发酵条件优化:论文确定了产抗病毒活性物质菌株的最适发酵条件,即发酵周期6d,温度28℃,摇床转速120rpm,培养基装量300ml/1000ml三角瓶,培养基的起始PH值7.0,接种量为10%。
[结论]
1 获取了6株能够稳定产生抗病毒活性物质的高产菌株;
2 掌握了紫外线、Co<60>、硫酸二乙酯及紫外线+氯化锂四种诱变方法;
3 确定最佳培养基组成为:马铃薯20%,蔗糖2.5%,MgSO<,4> 0.1%,KH<,2>PO<,4>0.3%。
4 确定了菌株发酵的最适发酵条件为:发酵周期6d,温度28℃,摇床转速120rpm,培养基装量300ml/1000ml三角瓶,培养基的起始PH值7.0,接种量为10%。