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帕金森病（Parkinson’s disease,PD）是第二大常见的神经系统退行性疾病。其主要的临床表现为运动迟缓,静止性震颤,姿势反射障碍等。PD的主要病理学特征是黑质（Substantia nigra,SN）多巴胺能神经元的进行性变性死亡。到目前,该病病因尚未明确,但最近越来越多的证据表明,SN铁过度沉积可能是PD发病的关键因素之一。SN区铁增加会产生活性氧和活性氮等物质,促进了细胞内α-突触核蛋白的形成,从而引起多巴胺能神经元变性死亡;SN区铁沉积也可能通过铁死亡的方式介导多巴胺能神经元的死亡。越来越多的证据表明,突触功能的改变可能与多种神经精神疾病的病理生理过程有关。在PD患者尸检研究中观察到纹状体（Striatum,Str）神经元的树突分支减少,树突棘密度降低。在PD状态下,Str中多巴胺（Dopamine,DA）的降低会降低棘突状投射神经元直接通路的活性及皮层兴奋性,且PD中DA的耗竭会导致大量树突的丢失。以上证据提示突触功能的改变参与了PD的发病。在哺乳动物的中枢神经系统中,谷氨酸是最重要的兴奋性神经递质,它在记忆、突触可塑性和神经元发育中起着非常重要的作用。突触传递效能的改变主要与N-甲基-D-天冬氨酸受体（N-methyl-D-aspartate receptor,NMDAR）和α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸受体（α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole-propionicacid receptor,AMPAR）的表达及其介导的诱发兴奋性突触后电位或电流变化有关。研究表明SN和Str存在大量的谷氨酸能投射纤维,同时该部位又存在铁沉积,提示两者之间可能存在着相互作用。本实验室的前期研究结果表明,NMDAR的过度激活会降低铁转出蛋白Ferroportin1的表达,增加铁转入蛋白二价金属阳离子转运蛋白1的表达,导致铁的转出减少,转入增加,从而增加了细胞内铁的聚积。但是,铁过载对于NMDAR、其他谷氨酸受体的表达及突触功能的影响尚不清楚。因此,本实验应用葡聚糖铁制备高铁Wistar大鼠动物模型,应用蛋白免疫印迹的实验方法检测了SN及Str的谷氨酸受体及突触功能相关蛋白的表达变化;在原代培养的腹侧中脑（Ventral midbrain,VM）神经元上,应用免疫荧光,流式细胞术,蛋白免疫印迹法,酶联免疫吸附（Enzyme linked immunosorbent assay,Elisa）等实验技术观察了枸橼酸铁铵（Ferric ammonium citrate,FAC）对神经元谷氨酸受体的表达及突触功能的影响并探讨其可能的机制。结果如下:1.Wistar大鼠腹腔注射葡聚糖铁或生理盐水4 h后,进行行为学检测。旷场实验结果显示,与对照组相比,葡聚糖铁组大鼠的运动总距离（P<0.01）,中央区频率（P<0.05）及中央区时间的百分比（P<0.05）均有明显降低,差异具有统计学意义。2.采用蛋白免疫印迹法检测SN及Str中多巴胺转运蛋白（Dopamine transporter,DAT）及单胺囊泡转运蛋白2（Vesicular monoamine transporter-2,VMAT-2）的表达变化。结果显示,与对照组相比,葡聚糖铁组大鼠SN区VMAT-2的表达无明显变化,DAT的表达下降（P<0.05）,差异具有统计学意义;而葡聚糖铁组大鼠Str中VMAT-2和DAT的表达与对照组相比均无明显改变。3.采用蛋白免疫印迹法检测SN及Str中NMDAR亚单位NMDAR1,NMDAR2A及NMDAR2B的表达变化。结果显示,与对照组相比,葡聚糖铁组大鼠SN区谷氨酸受体NMDAR1（P<0.05）,NMDAR2A（P<0.05）及NMDAR2B（P<0.05）的表达均明显下降,差异具有统计学意义。与对照组相比,葡聚糖铁组大鼠Str中谷氨酸受体NMDAR1（P<0.05）,NMDAR2A（P<0.01）及NMDAR2B（P<0.05）的表达均明显下降,差异具有统计学意义。4.采用蛋白免疫印迹法检测SN及Str中其他突触可塑性相关蛋白如AMPAR1,神经元活动调节的细胞骨架蛋白（Activity-regulated cytoskeleton-associated protein,Arc）和突触后密度蛋白95（Post-synaptic density 95,PSD-95）的表达变化。结果显示,与对照组相比,葡聚糖铁组大鼠SN中AMPAR1（P<0.05）,Arc（P<0.05）及PSD-95（P<0.01）的表达均下降,差异具有统计学意义。在葡聚糖铁组大鼠Str中AMPAR1（P<0.05）,Arc（P<0.05）及PSD-95（P<0.01）的表达与对照组相比亦明显下降,差异具有统计学意义。5.采用蛋白免疫印迹法检测SN及Str中神经元型一氧化氮合酶（Neuronsal nitric oxide synthase,nNOS）的表达变化。结果显示,与对照组相比,葡聚糖铁组大鼠SN中nNOS的表达明显增加（P<0.05）,差异具有统计学意义,而葡聚糖铁组大鼠Str中nNOS的表达与对照组相比无明显变化。6.在原代培养的VM神经元上,给与FAC处理24 h后,检测细胞内可变铁池（Labile iron pool,LIP）、活性氧（Reactive oxygen species,ROS）及线粒体膜电位的变化。结果显示,与对照组相比,FAC组细胞内LIP明显增加（P<0.01）,线粒体膜电位降低（P<0.01）,ROS水平增加（P<0.001）,差异具有统计学意义。7.采用蛋白免疫印迹法对VM神经元中的VMAT-2和DAT蛋白进行检测。结果显示,与对照组相比,FAC组中的VMAT-2表达降低（P<0.05）,差异具有统计学意义;而FAC处理后VM神经元的DAT的表达无明显改变。8.采用ELISA的方法检测VM神经元上清中谷氨酸水平,采用蛋白免疫印迹法检测细胞中NMDAR1,NMDAR2A及NMDAR2B的蛋白表达。结果显示,与对照组相比,FAC组VM神经元上清中谷氨酸水平明显增加（P<0.05）,差异具有统计学意义;FAC处理后VM神经元上NMDAR1（P<0.05）,NMDAR2A（P<0.01）及NMDAR2B（P<0.05）的表达均明显下降,与正常对照组相比,差异具有统计学意义。9.采用蛋白免疫印迹法对突触可塑性相关蛋白AMPAR1,PSD-95和Arc的表达进行检测。结果显示,与对照组相比,FAC处理组VM神经元中AMPAR1的表达明显降低（P<0.05）,Arc的表达也明显降低（P<0.05）,PSD-95的表达明显增加（P<0.01）,差异具有统计学意义。10.采用蛋白免疫印迹法对VM神经元膜蛋白中的NMDAR（NMDAR1,NMDAR2A,NMDAR2B）的表达进行检测。结果显示,与对照组相比,FAC处理组VM神经元膜上的NMDAR1的表达升高（P<0.05）,NMDAR2A的表达明显升高（P<0.05）,NMDAR2B的表达明显升高（P<0.05）,差异具有统计学意义。11.采用蛋白免疫印迹法对细胞中的nNOS的表达进行检测。结果显示,与对照组相比,FAC组nNOS的表达水平显著增加（P<0.05）,差异具有统计学意义。以上结果表明,葡聚糖铁诱导的高铁大鼠模型存在DA转运失衡,谷氨酸受体NMDAR、AMPAR及突触可塑性相关蛋白的表达降低,提示铁超载可能通过影响DA稳态、兴奋性突触传递和突触功能参与PD的发病;进一步的体外实验证实高铁可增加细胞内游离铁和ROS水平,降低线粒体膜电位;并能够通过增加PSD-95的表达使膜上的NMDAR的表达增加,尤其是NMDAR2B,增强NMDAR介导的兴奋性毒性,导致VM神经元损伤;此外,铁过载还能导致突触可塑性相关蛋白的表达降低,提示高铁可能通过影响突触可塑性参与多巴胺能神经元的功能调控。该研究结果将有助于进一步了解高铁对突触功能的调控作用及可能的机制,为研究铁沉积与突触功能的关系提供了实验基础。