【摘 要】
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本研究的目的是通过山羊体细胞核移植、胚胎细胞继代核移植技术生产转人t-PA 指形区缺失突变体基因山羊胚胎,通过荧光和PCR 检测,以期实现在胚胎植入前对外源基因整合表达检测;优化胚胎培养体系,提高转基因核移植胚的囊胚发育率。1. 比较了不同生长因子、季节和OM 液的pH 值对卵母细胞成熟的影响。（1）OM中分别添加10 ng/mL 的EGF,IGF 及EGF+IGF, IGF 组和EGF+IGF
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本研究的目的是通过山羊体细胞核移植、胚胎细胞继代核移植技术生产转人t-PA 指形区缺失突变体基因山羊胚胎,通过荧光和PCR 检测,以期实现在胚胎植入前对外源基因整合表达检测;优化胚胎培养体系,提高转基因核移植胚的囊胚发育率。1. 比较了不同生长因子、季节和OM 液的pH 值对卵母细胞成熟的影响。（1）OM中分别添加10 ng/mL 的EGF,IGF 及EGF+IGF, IGF 组和EGF+IGF 组卵母细胞的成熟率（80.0%和82.4%）高于EGF 组（73.8%）,极显著高于对照组（67.3%）。表明EGF 和IGF对山羊卵母细胞的体外成熟有促进作用。（2）比较了季节对卵母细胞体外成熟的影响,结果发现,12 月到次年1 月采集的卵母细胞体外成熟率最高（81.0%）;11 月采集的卵母细胞体外成熟率较高（74.1%）;3～5 月和9～10 月采集的卵母细胞体外成熟率接近（66.0%和69.6%）;6～7 月初采集的卵母细胞体外成熟率最差（55.1%）。（3）当OM 的pH 值为7.2 和6.8～7.0 时,卵母细胞成熟率为66.2%和61.0%,显著高于pH≥7.5 时的成熟率（50.9%）（p<0.05）。表明pH 值为7.2 时卵母细胞体外成熟率最高。2.比较了不同的激活方法对卵母细胞孤雌激活的影响,以及培养液（CR1aa或SOFaa）中添加不同类型的血清对孤雌激活胚体外发育的影响。（1）采用Eth + 6-DMAP 、A23187+6-DMAP和Ion+6-DMAP三种方法激活山羊卵母细胞,Eth + 6-DMAP组孤雌激活胚的卵裂率和囊胚率（35.2%和4.8%）显著低于A23187+6-DMAP组（68.9%和24.1%）和Ion+6-DMAP组（88.1%和48.0%）,表明以Ion+ 6-DMAP激活最为理想。（2）在培养液（CR1aa或SOFaa）与颗粒细胞共培养条件下,分别添加10%的发情牛血清（OCS）、胎牛血清（FBS）和新生牛血清（NCS）。CR1aa组分别添加OCS 和FBS后,孤雌胚囊胚率分别为48.1%和45.0%,显著高于添加NCS组（26.0%）。SOFaa液分别添加OCS 和FBS后,孤雌胚囊胚发育率分别为50.5%和48.7%,显著高于添加NCS组（29.3%）。表明CR1aa和SOFaa两种培养液都适宜于山羊孤雌胚的体外培养,添加10%的OCS和FBS可显著提高孤雌胚的囊胚发育率。3.改造牛BLG 基因的5′调控序列并克隆在质粒载体pMD-18T,标记为pBLG。利用Xho I 和EcoR I 双酶切pBLG和真核表达载体pEGFP-C1,回收目的片断并连接,得到的质粒标记为pEB,然后用SalI 和BamH I 双酶切质粒pEB 和ptPA,回收目的片断并连接,构建表达载体pBT。4.利用脂质体转染法导入外源基因,转染细胞48 h 后,在荧光显微镜下观察报告基因GFP 表达,发现表达良好。利用G418 进行抗性细胞克隆筛选33 d,细胞经PCR 检
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