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目前用于研究植物病原细菌效应子分泌与转运的主要是Cya报告系统,需要培育植物;BlaM(β-内酰胺酶)报告系统是最早为研究动物病原细菌而设计的,转化材料是细胞而非组织或生物整体,技术方便易行。作者借鉴BlaM报告系统,考虑寄主植物与病原细菌互作的特点,探索、建立了一套水稻原生质体与病原细菌互作介导BlaM标记效应子转运的实时检测技术。水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae,Xoo)与水稻细菌性条斑病菌(X oryzae pv.oryzicola,Xoc)是黄单胞菌的主要类群,也是水稻上的两种主要病原细菌。这类病原菌主要通过各种效应子(transcription activator-like effectors,TALEs)发挥其致病作用。在病原菌与寄主植物漫长的协同进化过程中,不同的TALE效应蛋白可以在不同水稻品种上发挥毒力因子或无毒基因的作用。在与寄主水稻的长期博弈中,病原菌将有利于自身侵染和繁殖的TALE效应蛋白保留,这些TALE效应蛋白(如来自Xoo菌株中的PthXo1)通常发挥着毒力因子的作用。这种类似转录激活因子的效应子在寄主水稻上通常有着特定的靶标基因,当黄单胞菌侵染水稻时,这类毒力因子会通过Ⅲ型分泌系统(Type Ⅲ secretion,T3SS)转运到寄主水稻细胞内,并引起寄主植物中特定靶标基因的表达。前人研究发现Xoo的TALE效应子PthXo1可以诱导其靶标基因OsSWEET11的上调表达,从而影响病菌的致病性或寄主的防卫反应。但在OsSWEET11上调表达后,协助其从细胞核向外输出的核输出蛋白有哪些并不清楚,植物中关于核输出蛋白的研究也很少。因此,本研究希望鉴定出能够协助PthXo1的靶标基因OsSWEET11mRNA进行运输的核输出蛋白。主要结果如下:本研究选定Xoo中的TALE效应因子PthXo1,利用本实验室已构建成功的敲除及回补等菌株(PX099、△PthXo1、△PthXo1/PthXo1),对感病品种日本晴进行接种实验。而后通过实时荧光定量PCR技术分析不同菌株接种后的日本晴中6个Exportin基因的表达水平,发现在接种6h、12h后,PthXo1可以诱导ExportinT、Exportin4、Exportin7的上调表达;接种 24h、48h 后,PthXo1 可以诱导 Exportiin7 的上调表达,因此推测Exportin7可以协助OsSWEET11mRNA从细胞核输出。为验证这一猜想,本研究选定Exportin7为候选基因进行后续实验。将OsExportin7构建到植物表达载体pCAMBI1300上,通过原生质体介导的染色质免疫共沉淀(chromatin immunoprecipitation assay,ChIP)技术,发现 Exportin7 与 OsSWEET1 1 的启动子区和CDS区互作,这证明Exportin7可协助PthXo1的靶标基因OsSJWEET11mRNA从细胞核进行输出。为进一步证明Exportin7确有核输出的功能,同时也为了明确Exportin7在细胞中的位置,本研究又将Exportin7连接到植物表达载体pCAMBI1300::YFP上,并在烟草中进行瞬时表达实验,结果发现Exportin7定位于细胞核内,这也充分证实了ChIP-PCR的实验结果。为探究TALE效应子PthXo1与Exportin7的互作关系,本研究运用了酵母双杂交技术(yeast two-hybrid system),发现PthXo1与Exportin7并不互作。为测定PthXo1对非寄主植物烟草的过敏反应,本研究将PthXo1突变体等相关菌株注射烟草观察过敏反应,结果表明缺失PthXo1可以减弱黄单胞菌在非寄主植物烟草上的过敏反应。又测定了可能与PthXo1相关的一些水稻抗感病基因(Xa1、xa5、Xa13、xa13、Xa3/26)在PthXo1突变体等相关菌株接种水稻后的表达水平,结果证明PthXo1可以诱导感病基因Xa13、Xa3/26的上调表达,并抑制抗病基因xa13的表达,而Xa1基因的表达无显著变化。这其中Xa13正是PthXo1的靶标基因OsSWEET11,本研究结果也与前人的一致。