猪源肠外致病性大肠杆菌的分离鉴定及生物学特性研究

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大肠杆菌(E.coli)是猪群中很多疾病,包括新仔猪腹泻、断奶仔猪腹泻、败血症、多发性浆膜炎、乳房炎、尿路感染的一个重要原因。肠外致病性大肠杆菌(Ex PEC)是一组不同种类的E.coli,不仅可正常定植于肠道,而且能侵入引起菌血症,并诱发败血症或局部肠道外感染,如脑膜炎、关节炎、肺炎、心内膜炎等。近年来,规模猪场着重加强对猪繁殖与呼吸综合征、猪圆环病毒病、猪瘟、猪伪狂犬病、猪链球菌病、副猪嗜血杆菌病等疫病的防控,却忽视了由猪源Ex PEC引起的发病率和病死率逐年升高,从而导致经济损失的日益显著。目前,关于Ex PCE的研究报道多聚焦于禽和人源上。为有效防控猪源Ex PEC对猪群健康产生的危害,开展猪源Ex PEC的生物学特性研究,了解和掌握这些猪源Ex PEC的病原学特征、毒力与致病性以及对抗菌药物的感受性等意义显著,研究结果可为后续Ex PEC病的预防和治疗奠定基础。本研究对象源自某集团公司养殖场的172头病猪,发病猪至少包含高热、咳喘、关节肿大、皮肤发绀、败血症、脑膜炎等临床症状中的一种。试验内容:(1)采集病猪肠道外组织接种麦康凯培养基(MAC)作细菌分离培养,经革兰氏染色镜检和生化试验鉴定为肠外E.coli后,通过小鼠致病性试验确定为Ex PEC。(2)对猪源Ex PEC分离菌,依次采用5%脱纤维绵羊血和脱纤维兔血琼脂平板进行体外溶血性试验,玻板凝集试验和试管凝集试验进行O抗原血清型鉴定,PCR技术进行系统进化群相关基因、多位点序列分型相关基因和28个Ex PEC相关毒力基因检测,纸片琼脂扩散法(K-B法)进行22种药物敏感性试验,96孔微量板法进行生物膜(BF)形成能力测定以及累计法对部分代表菌株进行小鼠半数致死量(LD50)测定。(3)应用统计软件SPSS 25.0对猪源Ex PEC分离菌系统进化群与毒力基因及BF形成与耐药性、毒力的相关性分析。结果显示:(1)172头病猪中有33头分离出Ex PEC,分离率为19.2%,分离菌共计54株,其中19株(35.2%)分离自肺脏。(2)54株Ex PEC均呈γ溶血。分离菌中40株为O38(74.1%)、8株O127(14.9%)、O11和O93均2株(各占3.7%)、2株未定型(3.7%)。分离菌中44株为系统进化B2群(81.5%)、D群和B1群均2株(各占9.3%)。分离菌共呈现31种ST型,其中ST648和ST10均5株(各占9.3%),ST410和ST101均4株(各占7.4%)。分离菌中omp A、ibe A、fim H、tra T、foc D、pap A、iro N、iut A、iuc D、cva C、tsh、kps MTⅡ、iss和omp T基因出现的频率超过50%,其中omp A检测率为100%,其次是ibe A(96.3%),未检测到cnf1。54株Ex PEC均为多重耐药,51株耐10种以上(94.4%),呈现46种耐药谱,以PEN+AMX+AMP+CFZ+CA+CRO+STR+GEN+RAN+AMK+TE+DX+TMP+SXT的构成比最大(10.9%)。38株分离菌形成BF,成膜阳性率70.4%(38/54),其中7株(13.0%)成膜力强(3+)、3株(5.6%)成膜力中等(2+)、28株(51.9%)成膜力弱(1+)。分离菌中8株代表菌的LD50在7.9×109CFU/m L~6.3×106CFU/m L,其中AHshou18-4和AHshou18-8的LD50分别为6.3×106CFU/m L和7.9×106CFU/m L,均属于高致病性菌株。(3)分离菌BF形成与头孢氨苄耐药性呈正相关,成膜力(1+)菌与未成膜(-)菌的LD50值之间无显著差异。结果表明:Ex PEC分离率为19.2%,猪群中感染较普遍,肺脏是其主要感染部位。分离株均呈γ溶血,溶血性特征除与溶血素基因表达关联外,可能也同分离菌来自感染症的不同类型有关。分离株O抗原血清型以O38为优势,目前尚无见报道,源自不同感染症类型、不同动物、同一动物不同地区的Ex PEC优势血清型不同。分离株以B2群为主,系统进化群呈动态变化,强致病性Ex PEC有逐渐增多的趋势。omp A和ibe A为高度流行的毒力基因,猪源Ex PEC的致病与生存力越来越强。31种ST型中以ST10和ST648最多,呈现遗传多样性,且在分子上与人、禽Ex PEC具有一定程度上的相似遗传背景和来源。分离株BF阳性率为70.4%,以成膜力(1+)为主,BF的成膜率和成膜力与菌株生存的多种外界环境因素的变化密切相关。分离株均为多重耐药,耐药谱复杂多样,BF形成与对头孢氨苄的耐药性呈正相关。成膜力(1+)菌与未成膜(-)菌的LD50值之间差异不显著。
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