无核是柑橘育种的重要目标之一。近年来,利用细胞融合技术,并结合传统的有性杂交、胚抢救培养方法已获得大量的无核新种质。但由于柑橘童期较长,基于杂交的育种方法耗时费力,到目前为止,绝大多数材料尚未获得新品种认证。利用芽变选种仍是获得无核柑橘的重要途径。然而,柑橘育种者一方面对芽变机理认识不足,另一方面,对柑橘无核性状形成的分子机理研究较少,制约了对柑橘无核资源的发掘和利用。因此,利用现代分子生物学手段探究柑橘无核形成机理,对认识和利用木本植物无核芽变或变异规律,加快柑橘无核育种进程具有重要意义。本研究以“黔阳无核”桠柑(Qianyang seedless,QS)为研究材料,以“鄂柑一号”桠柑(Egan No.1,EG)为对照,结合细胞学、遗传学分析QS无核性状的成因,同时利用抑制性差减杂交(SSH)文库结合定制芯片以及RNA-seq等技术,从转录水平分析QS雄性不育和无核的分子机理。主要研究结果如下：1.QS无核产生的原因以及QS和EG在DNA水平的差异分析。通过花粉扫描电镜观察、花粉染色、体外萌发以及人工授粉等试验,确定QS无核的原因是雄性不育且雌蕊发育异常。QS与EG的花器官形态正常,均能产生大量花粉,但QS花粉量比EG少约3 1%。花粉活力检测显示：QS平均染色活力约6%,而EG在90%以上;QS花粉粒体外萌发率为0,而EG在10%左右。进一步利用扫描电镜观察发现QS花粉粒形态大小不一,外观畸形；而对早期花药压片观察发现QS花粉母细胞减数分裂异常,形成大量异常四分体。对QS进行人工授粉,花粉粒在柱头能正常萌发,但果实仍无核。对QS与EG进行分子标记(172对SSR引物,96对MSAP甲基化引物,13对多态性强的AFLP引物以及2对SCAR引物)分析。结果表明,从核基因组上无法获得稳定的多态性条带,说明QS与EG不仅外观差异很小,且遗传背景高度一致。2.为鉴定、克隆QS无核芽变相关的基因,构建了QS与EG混合花器官SSH-cDNA文库。采集现蕾期(约25 DBF)、花蕾期(5-10 DBF)、盛花期(0 DBF)花蕾以及花后幼嫩子房(2-3 DAF),分别提取RNA,等量混合建库。共获得10944个单克隆(正向8832个,反向2112个),保存在29个384板中。为筛选阳性差异克隆,从文库中随机挑取约8000个克隆,进行PCR扩增,获得6048个(正向4195个,反向1853个)高质量的单克隆PCR产物,并以这些纯化后的PCR产物为探针,定制microarray。通过microarray杂交筛选,在四个时期的组织中共获得255个非重复的差异克隆(FDR<0.05 and a fold change≥2),其中75%的克隆下调表达。对差异克隆进行EST测序以及序列分析,获得了133条unigenes,并发掘了一些重要的候选基因。如花粉外壁形成相关的脂酰还原酶基因Male sterile-like protein;一系列参与生殖发育的转录因子,如AP2-ERF/EREBP、MYB、bHLH类蛋白；许多参与脂类物质转运、能量代谢的基因,如LTPs(lipid-transfer proteins),proton-exporting ATPase等。GO-KEGG分析显示差异基因主要参与代谢、调控、碱基／核酸代谢以及响应外界刺激等生物过程；且大多数参与物质和能量代谢相关的基因在QS中表达下调;而转录因子和内源激素可能在QS雄蕊发育过程中起重要的作用。为深入研究桠柑雄蕊败育的分子调控机制,分离直径约3 mm左右花蕾(SF)以及盛花期的花药(AN),利用illumina高通量测序技术,结合数字基因表达谱(digital gene expression tag profiling,DGE)RNA测序,在全基因组水平研究差异表达的基因。4个测序文库共生成46百万条读段(read),获得差异基因(QS相对EG)情况如下：SF中上调391个,下调508个：AN中上调289个,下调4226个。可以看出下调基因明显居多。通过初步分析,发现在SF中,差异上调倍数最高的10个基因中,有3个漆酶(laccase)多基因家族成员,该类基因主要参与木质素生物合成代谢,并影响植物生长发育；另有1个果胶甲酯酶基因和1个微管相关蛋白基因,主要参与细胞壁结构和生物合成：而差异上调倍数最大的是核小体组装蛋白(Nucleosome assembly protein)编码基因,主要参与DNA代谢过程。而在下调倍数最高的10个基因中,7个属于热激蛋白家族基因。花药中,上调表达的基因包括：细胞色素P450-76. MYB102、衰老相关基因1(SRG1)、 PAR1等；而下调表达的基因包括：NAC TF、PHS1 (poor homologous synapsis 1)、脂转蛋白(LTPs)和生长素响应蛋白基因等。3.为分析激素在QS雄蕊发育中可能的作用,测定了不同组织(老叶、3mm花蕾、盛花期整花蕾、盛花期花药、盛花期子房)内源激素含量。其中ABA, SA,ACC含量很低,无法检测。QS和EG各组织中,IAA含量保持在相对较低的水平(2.1-2.7 ng/g), JAs含量在成熟花药中含量很高(29.8-39.5 ng/g),而在其他组织中相对较低。总体来看,各组织中IAA含量较稳定,在QS中含量略低于EG;而JAs-Ile在花药中特异积累,除了盛花期花蕾,其他组织中的含量也是QS低于EG。同时,利用qRT-PCR分析了JAs生物合成代谢途径相关基因的表达变化,与JAs含量变化较一致。4.利用RT-PCR技术,克隆了MSLP和AP2-ERF TF基因全长;并采用qRT-PCR分析了其在QS和EG发育过程的表达模式。MSLP主要在盛花期子房(OV1)中表达,而在盛花期花药(AN)中的表达水平较低；且在整个发育过程中,MSLP在QS中的表达显著高于EG。AP2-ERF TF主要在SF和BF中表达,同样也是在QS中的表达量高于EG。此外,分析了6个典型柑橘品种中MSLP和AP2-ERF TF的cDNA全长序列,发现MSLP在柑橘中至少具有4个不同的转录本,而AP2-ERF TF仅有1个：基因组拷贝数分析显示,MSLP有5-8个拷贝,而AP2-ERF TF有1-2个拷贝。以上研究证实了“黔阳无核”雄性不育特性,同时发现胚囊存在败育现象。利用SSH和RNA-seq在转录水平鉴定到许多雄雌蕊发育相关的基因,这些基因为理解无核芽变提供了线索,并为无核分子育种打下基础。