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白菜类作物原产我国,栽培历史悠久且品种丰富。在植物学分类上,白菜类作物隶属十字花科(Cruciferae)芸薹属(Brassica),主要包括大白菜(Brassica rapa ssp.pekinensis)、不结球白菜(Brassica rapa ssp.chinensis)和芜菁(Brassica rapa ssp.rapa)。其中,不结球白菜是我国长江中下游广泛种植的大众蔬菜。与拟南芥一样,不结球白菜也通过一系列的转录调控机制来诱发冷驯化,从而提高其耐寒性,而由CBF转录因子家族基因主导的CBF冷响应通路是这些转录调控机制中最重要的组成之一。因而系统的研究CBF冷响应通路对于更好的认识不结球白菜的抗寒甚至其他环境胁迫的调控机制非常重要。本研究分离和克隆了不结球白菜的CBF基因,分析其胁迫表达模式及调控特点,并进一步研究上游BcWRKY33对BcCBF3基因的调控关系;通过小RNA测序技术挖掘CBF在关联不结球白菜的抗寒和病原响应机制中的作用;此外,对近缘亚种大白菜进行MYB转录因子的全基因组鉴定分析,并以此作为对不结球白菜及整个白菜类作物CBF基因上游调控因子MYB的研究的参考。本文主要研究结果如下:1.从不结球白菜品种’苏州青’中分离得到8个CBF同源基因,其编码的BcCBF蛋白与拟南芥中的同源蛋白相似性较高。实时定量PCR(qPCR)分析表明,BcCBF1～3被冷胁迫(4℃)而非干旱或脱落酸(ABA)诱导,它们参与了ABA-独立路径;而BcCBF4～6的表达受到干旱和ABA调控,它们参与ABA-依赖路径。与拟南齐的同源基因不同,BcCBF4～6表现出的低温和ABA响应,暗示在不结球白菜中,CBF通路的ABA依赖路径和ABA独立路径并不是完全分开的,而这些基因可能作为两者的联系点。2.利用Gateway技术构建了4个不结球白菜BcCBF基因的过量表达载体,转化洋葱表皮细胞进行亚细胞定位,结果表明这四个BcCBF蛋白都定位在细胞核中。用含有BcCBF3-pEarleyGate103的农杆菌蘸花法转化拟南芥;通过酶切连接获得BcCBF3的甘蓝缩叶病毒(Cblcv)诱导的基因沉默载体BcCBF3-PCVA并得到不结球白菜的瞬时表达转基因植株。在拟南芥中,AtCBF2受到BcCBF3过表达显著抑制,而实时定量分析表明BcCBF2的表达与BcCBF3无直接关系。其上游的BcMYB15则受BcCBF3表达量的反馈抑制,下游BcCOR15A表达与BcCBF3正相关并放大其表达的变化。3.对BcCBF3的启动子序列进行分析,鉴定出两个WRKY结合顺式元件W-box。盐处理表达模式及烟草的GUS染色结果表明两个W-box对于WRKY的结合都有作用。进一步对BcWRKY33的过量表达不结球白菜中CBF相关基因进行表达分析,结果表明BcWRKY33的组成型表达激活了BcCBF3的转录,而在低温下它们的表达变化都要大于未处理时。BcCBF4在转基因植株中的表达模式表明虽然它与WRKY33都响应ABA,但彼此对ABA的响应机制是独立的。此外,BcWRKY33的原核表达获得了BcWRKY33-GST重组蛋白,为实验验证蛋白-DNA互作打下基础。4.以感染芜菁花叶病毒和健康的叶子为材料进行小RNA测序,测序挖掘出86个保守和45个新的的miRNA。其中,共69个miRNA响应TuMV侵染,包括42个下调和27个上调miRNA。利用生物信息学方法预测的共有271个靶基因,这些基因主要参与发育调控和胁迫响应。选择了13个miRNA及其相应的靶基因,探索其在TuMV或冷胁迫下的表达模式。结果表明,一些TuMV响应的miRNA也被低温诱导,其可能作为两种胁迫响应机制的联结。5.对白菜类作物CBF基因的启动子顺式元件进行分析,结果显示其都含有MYB结合元件,表明MYB转录因子在白菜类作物CBF上游调控中具有普遍性作用。随后,从大白菜中鉴定出了256个及2R3-MYB基因,通过进化树分析将大白菜中的273个R2R3-、3R-和非典型的MYB蛋白分成45个亚组。RNA表达谱数据和实时定量PCR(qPCR)分析则反映了R2R3-BrMYB基因的组织差异表达特性及对环境胁迫和ABA信号的响应表达模式。结果表明,C11、C14、C31、C36和C38等亚组成员可能参与大白菜的多胁迫应答机制,C42亚组MYB基因可能是低温信号转导中特异的转录调控因子。这些亚组成员中存在着冷相关CBF基因的上游调控因子。