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第一部分GTP环化水解酶1（GCH1）在肝细胞癌组织和肝癌细胞中的表达及其临床意义背景和目的:肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）是原发性肝癌的主要病理类型。代谢重编程是包括肝癌细胞在内所有肿瘤细胞的特征之一。积极寻找HCC的代谢调节因子,对于深入理解代谢重编程在其发生发展中的作用具有重要意义。GTP环化水解酶1（GTP cyclohydrolase 1,GCH1）是四氢生物喋呤（tetrahydrobiopterin,BH4）从头合成途径的限速酶。本部分拟探讨GCH1在肝细胞癌组织和肝癌细胞中的表达及其临床意义。方法:（1）我们使用RT-qPCR和Western blotting检测肝细胞癌组织和配对癌旁组织以及永生化肝细胞MIHA和肝癌细胞中GCH1的表达水平。同时,我们使用甲基化特异性PCR评估GCH1启动子区的甲基化状态。（2）基于组织芯片,我们在两个独立的队列中分析GCH1表达水平和HCC患者临床病理特征、总生存率和无复发生存率的关系,并利用单因素和多因素Cox比例风险回归模型探讨GCH1表达水平与总生存率和无复发生存率之间的关系。结果:（1）与癌旁组织或永生化肝细胞MIHA相比,GCH1在肝细胞癌组织或肝癌细胞中普遍低表达。甲基化特异性PCR显示:GCH1在HCC中的低表达是由于启动子区甲基化造成的。（2）在重庆队列中,GCH1表达水平与性别（P=0.02）,巴塞罗那临床肝癌分期（P<0.01）、肿瘤大小（P<0.01）和肿瘤数目（P=0.02）显著相关;在四川队列中,GCH1表达水平与甲胎蛋白水平（P=0.01）、ALT水平（P=0.02）、肿瘤大小（P=0.02）和肿瘤数目（P=0.02）显著相关。在重庆和四川队列中,Kaplan-Meier生存曲线显示:GCH1低表达组HCC患者的总生存率（P<0.01）和无复发生存率（P<0.01）显著低于GCH1高表达组;同时,多因素Cox回归提示:GCH1表达水平是HCC患者总死亡率和无复发死亡率的独立预测因素（P<0.05）。结论:GCH1由于启动子区甲基化在肝细胞癌组织和肝癌细胞中普遍低表达;GCH1低表达是HCC患者不良预后的预测因子。第二部分GCH1沉默促进肝癌细胞的增殖背景和目的:既往研究发现:GCH1能够促进小鼠黑色素瘤细胞和人乳腺癌细胞的增殖以及人胶质母细胞瘤的生长。本部分拟探讨GCH1表达水平的改变对肝癌细胞的增殖、迁移和诱导血管发生等表型的影响。方法:（1）我们使用CCK-8实验、平板克隆形成实验和EdU实验以及HCC皮下移植瘤模型评估GCH1表达水平的改变对肝癌细胞增殖的影响。（2）我们使用划痕实验评估GCH1表达水平改变对肝癌细胞迁移能力的影响。（3）我们使用人脐静脉内皮细胞脉管形成实验评估GCH1表达水平改变对肝癌细胞诱导血管形成能力的影响。（4）我们使用流式细胞术检测GCH1表达水平改变对细胞周期和细胞凋亡的影响。（5）我们使用Western blotting检测GCH1表达水平改变对cleaved caspase-3、Bax和Bcl-2表达水平的影响。结果:（1）CCK-8实验、平板克隆形成实验和EdU实验显示:GCH1过表达会显著抑制肝癌细胞的生长活力（P<0.05）和抑制肝癌细胞的增殖能力（P<0.05）,而GCH1沉默则具有相反的效应。同时,裸鼠皮下成瘤实验显示:GCH1沉默组的移植瘤重量（P<0.05）和体积（P<0.05）显著高于对照组。（2）流式细胞术显示:GCH1过表达会促进细胞凋亡（P<0.05）,而GCH1沉默则会抑制细胞凋亡（P<0.05）;Western blotting实验显示:GCH1过表达会促进cleaved caspae-3和Bax的表达、抑制Bcl-2的表达;GCH1沉默则具有相反的效应。（3）划痕实验显示:GCH1表达水平改变对肝癌细胞迁移能力无显著影响（P>0.05）;同时,人脐静脉内皮细胞脉管形成实验显示:GCH1表达水平改变对肝癌细胞诱导血管形成的能力无显著影响（P>0.05）。结论:GCH1低表达会显著地促进肝癌细胞的增殖,而对肝癌细胞的迁移能力和诱导血管形成能力无显著影响。第三部分GCH1沉默的促增殖效应是BH4合成减少的直接结果背景和目的:GCH1是BH4从头合成途径的限速酶,催化GTP转化为二氢新蝶呤三磷酸盐。本部分的研究目的是明确GCH1在HCC中的生物学功能是否依赖于其催化产物BH4。方法:（1）我们使用BH4酶联免疫分析试剂盒检测GCH1过表达和沉默之后细胞内BH4水平的变化。（2）我们通过CCK-8实验和HCC皮下移植瘤模型明确外源性BH4对肝癌细胞增殖的影响以及BH4合成减少是否介导了GCH1沉默的促增殖效应。结果:（1）GCH1过表达之后,细胞内BH4水平显著上升（P<0.05）;而GCH1沉默之后,细胞内BH4水平显著下降（P<0.05）。（2）CCK-8实验显示:BH4在体外能够显著抑制肝癌细胞的增殖;同时,裸鼠皮下移植瘤实验显示:BH4处理组的裸鼠皮下瘤的体积和重量显著低于对照组裸鼠皮下瘤的体积和重量。（3）回复实验显示:外源性BH4能够逆转GCH1沉默的所带来的促增殖效应。结论:BH4在体内外对肝癌细胞的生长均具有抑制效应;BH4从头合成的减少介导了GCH1沉默在HCC中的促增殖效应。第四部分GCH1沉默通过激活ASK1/p38信号来促进肝癌细胞的增殖背景和目的:第1-3部分的实验发现:GCH1沉默会促进肝癌细胞的增殖。本部分拟探讨GCH1沉默促进肝癌细胞增殖的分子机制。方法:（1）我们使用Western blotting来筛选常见的肿瘤信号通路,并进一步通过RT-qPCR来检测下游基因的mRNA表达水平的变化。（2）我们使用SB203580和si RNA进行回复实验以明确p38信号是否介导了GCH1沉默所带来的促增殖效应。（3）我们使用Western blotting检测ASK1磷酸化水平的改变,并使用ASK1信号的抑制剂selonsertib来明确ASK1信号是否是p38信号的上游。结果:（1）Western blotting实验发现:GCH1沉默激活了p38信号;同时,RT-qPCR实验发现:GCH1沉默之后,p38信号正向调节的下游基因的mRNA表达水平显著上调。（2）SB203580抑制了p38信号的激活,并且逆转了GCH1沉默所带来的促增殖效应。（2）RNAi实验发现:沉默p38α或p38γ会抑制肝癌细胞的增殖;同时沉默p38α和p38γ会逆转GCH1沉默所带来的促增殖效应。（3）Western blotting实验发现:GCH1沉默上调了ASK1的磷酸化水平;在使用selonsertib抑制ASK1信号后,p38信号也受到显著抑制。结论:GCH1沉默通过激活ASK1/p38信号通路来促进肝癌细胞的增殖。第五部分O2·-的增加是GCH1沉默激活ASK1/p38信号通路的中间环节背景和目的:上述实验表明:GCH1沉默通过激活ASK1/p38信号通路来促进肝癌细胞的增殖。本部分拟探讨GCH1沉默是如何激活ASK1/p38信号通路的。方法:（1）我们使用Western blotting来检测BH4对ASK1/p38信号通路的影响。（2）我们使用DHE荧光探针检测BH4对细胞内O2·-水平的影响。（3）我们使用氧自由基清除剂NAC来进行回复实验,以明确O2·-水平的增加是否介导了GCH1沉默所致的ASK1/p38信号的激活。结果:（1）Western blotting实验发现:BH4以剂量依赖的方式抑制了ASK1/p38信号通路的激活。（2）GCH1沉默会通过抑制BH4的从头合成来上调细胞内O2·-水平。（3）回复实验显示:O2·-水平的增加介导了GCH1沉默所致的ASK1/p38信号通路的激活。结论:GCH1沉默通过促进细胞内O2·-的产生来激活ASK1/p38信号通路。