第一部分肽功能化重组高密度脂蛋白纳米粒的构建及表征检测目的:制备肽功能化重组高密度脂蛋纳米粒。检测纳米的形态、粒径分布、表面电位。检测纳米粒对GANT和PTX的包封率、载药效率以及纳米粒的药物释放特性。方法:采用薄膜水化法制备肽功能化重组高密度脂蛋纳米粒tLyP-1-rHDL-PTX/GANT61。透射电镜观察纳米粒的形态结构,并采用激光粒径仪检测纳米粒的粒径分布和表面电位。使用高效液相色谱法检测纳米粒对PTX和GANT61的包封率、载药效率以及tLyP-1-rHDL-PTX/GANT61在不同pH条件下的药物释放性能。结果:制备了肽功能化重组高密度脂蛋纳米粒tLyP-1-rHDLPTX/GANT61及其对照组LNP-PTX/GANT61、rHDL-PTX/GANT61、tLyP-1-LNP-PTX/GANT61。透射电镜显示各组纳米粒都呈均一的球体。激光粒径检测仪测得四组纳米粒的粒径分别为:127.7±29.69nm、104±27.4nm、124±35.06nm、119±32.1nm;表面电位分别为:-5.52±3.52m V、-7.07±3.66m V、-17.1±6.3m V、10.9±4.1m V,高效液相色谱法测得四组纳米粒对PTX的包封率分别是:83.4±2.1%、81.6±4.1%、83.2±3.6%、79.2±0.7%,对GANT61的包封率分别是:75.2±1.3%、75.9±4.1%、73.1±1.2%、67.3±2.1%。tLyP-1-rHDL-PTX/GANT61纳米粒在pH 7.4的条件下48小时内PTX和GANT61的释放量分别为15.6±5.2%和18.7±4.4%,该纳米粒在pH 5.5的酸性条件下48小时内PTX和GANT61的释放量分别为53.2±3.7%以及56.2±7.2%。结论:肽功能化重组高密度脂蛋白纳米粒的制备流程简便,产出稳定。纳米粒直径分布均匀,表面带负电荷,对PTX和GANT61两种药物均有可观的包封率和载药效率。tLyP-1-rHDL-PTX/GANT61在中性条件下结构稳定,在酸性条件下药物释放明显增多,该特性有利于药物在肿瘤组织中的释放。第二部分肽功能化重组高密度脂蛋白纳米粒的靶向性研究目的:观察tLyP-1-rHDL-PTX/GANT61纳米粒对人三阴乳腺癌细胞MDA-MB-231和BT-549的靶向效应,并观察纳米粒在这两株细胞所构建的肿瘤细胞球中的穿透效应。建立小鼠乳腺癌原位移植瘤模型,观察纳米粒在体内的肿瘤靶向效果。方法:激光共聚焦显微镜观察不同靶向效能的纳米粒:LNP-PTX/GANT61、rHDL-PTX/GANT61、tLyP-1-LNP-PTX/GANT61、tLyP-1-rHDL-PTX/GANT61与MDA-MB-231和BT-549细胞共孵育后在肿瘤细胞上的聚集情况,并使用流式细胞仪做荧光强度的定量分析。通过3D培养的方法构建MDA-MB-231和BT-549的肿瘤细胞球模型,通过激光共聚焦显微镜的逐层扫面来检测各组纳米粒对肿瘤细胞球的穿透效应。建立MDA-MB-231细胞原位移植瘤模型,利用小动物活体成像系统进行体内靶向性检测。尾静脉注射不同组别的纳米粒,在注射后的2、6、12、24小时进行活体成像,观察纳米粒在肿瘤内的聚集情况。24h的图像采集完毕后,将小鼠处死并提取肿瘤以及心、肝、脾、肺、肾进行离体组织成像。结果:激光共聚焦图像和流式细胞检测均提示无靶向效能的纳米粒LNP-PTX/GANT61几乎不被肿瘤细胞摄取,单一靶向纳米粒rHDLPTX/GANT61和tLyP-1-LNP-PTX/GANT61可主动靶向肿瘤细胞,对比rHDL-PTX/GANT61,tLyP-1-LNP-PTX/GANT61纳米粒更多的进入肿瘤细胞胞质内,双重靶向纳米粒tLyP-1-rHDL-PTX/GANT61在肿瘤细胞中的富集最多。激光共聚焦显微镜逐层扫描的图像中可以观察到,无靶向效能的LNP-PTX/GANT61纳米粒在肿瘤细胞球上的富集不明显。单一靶向效能的rHDL纳米粒在肿瘤细胞球的表面可见明显的聚集,肽功能化靶向纳米粒tLyP-1-rHDL-PTX/GANT61不仅在肿瘤细胞球的表面聚集,还能够穿透进入肿瘤细胞球的内部。活体成像提示4组纳米粒均可在肿瘤组织中聚集,信号强度随着时间推移而增强并在24小时达到最强。非靶向组纳米粒在瘤体内的聚集较少,单一靶向纳米粒rHDL-PTX/GANT61和tLyP-1-LNP-PTX/GANT61在瘤体组织中可见一定程度的聚集,tLyP-1-rHDL-PTX/GANT61在活体内的靶向能力最为显著。离体肿瘤组织的成像结果与活体成像的结果一致。结论:tLyP-1-rHDL-PTX/GANT61在体外实验中对MDA-MB-231和BT-549细胞均有优秀的靶向效能,且在3D培养的肿瘤球模型中可以穿透到肿瘤球深部。在瘤荷鼠模型中tLyP-1-rHDL-PTX/GANT61纳米粒可以有效的靶向肿瘤组织,实现药物的靶向递送。第三部分肽功能化重组高密度脂蛋白纳米粒对三阴乳腺癌细胞毒性的评估目的:检测未装载药物的纳米粒载体的生物相容性,检测肽功能化载药纳米粒对三阴乳腺癌细胞的抗增殖和促凋亡作用。方法:用CCK8实验检测未装载药物的纳米粒载体（LNP、rHDL、tLyP-1-LNP、tLyP-1-rHDL）对肿瘤细胞是否具有细胞毒性。CCK8实验检测不同靶向效能的载药纳米粒对MDA-MB-231和BT-549的细胞毒性,并用流式细胞凋亡检测观察不同靶向效能的载药纳米粒对三阴乳腺癌细胞的促凋亡效应。结果:未装载药物的纳米粒载体对MDA-MB-231和BT-549细胞没有明显的细胞毒作用。CCK8实验和流式细胞实验提示载药纳米粒对三阴乳腺癌细胞有明确的抗增殖和促凋亡作用,且该效应随着纳米粒靶向效能的增强而增强,双重靶向载药纳米粒tLyP-1-rHDLPTX/GANT61对三阴乳癌腺癌细胞的抗增殖和促凋亡作用显著优于药物溶液、非靶向组及单一靶向组载药纳米粒。结论:肽功能化重组高密度脂蛋白纳米粒载体的生物相容性好,是作为药物载体的理想选择。肽功能化重组高密度脂蛋白载药纳米粒tLyP-1-rHDL-PTX/GANT61对三阴乳腺癌细胞的抗增殖和促凋亡效应明显优于PTX+GANT61溶液,更好的发挥了药物的的抗肿瘤效应。第四部分肽功能化重组高密度脂蛋白纳米粒抑制三阴乳腺癌细胞转移相关表型的体外实验目的:分析GLI1的表达对乳腺癌患者预后的影响。验证GANT61以及载药纳米粒对MDA-MB-231和BT-549细胞SHH通路的抑制效能。观察GANT61和载药纳米粒对于三阴乳腺癌细胞迁移、侵袭、新生血管等肿瘤转移相关表型的影响。方法:通过GEO数据库的挖掘,评估GLI1的表达量对乳腺癌患者的总生存（OS）、无复发生存（RFS）、无病生存（DFS）等预后指标的影响。Western Blot检测GANT61和载药纳米粒对MDA-MB-231和BT-549细胞的SHH、GLI1表达的影响。通过划痕实验、Transwell实验评估GANT61以及载药纳米粒对三阴乳腺癌细胞迁移、侵袭能力的抑制作用。通过Wseten Blot检测上皮-间质转化相关蛋白Vimentin、Snail和E-cadherin的变化。通过HUVEC细胞小管形成实验评估GANT61以及载药纳米粒对三阴乳腺癌细胞血管新生能力的影响,通过q RT-PCR检测VEGF-A、VEGFR2、s VEGFR2、THBS1等血管新生相关分子的变化情况。结果:GLI1是乳腺癌患者预后的敏感指标,GLI1高表达的患者的患者OS、DFS、RFS均明显劣于GLI1低表达的患者。GANT61和载药纳米粒对MDA-MB-231和BT-549细胞的SHH通路有抑制作用。非靶向载药纳米粒LNP-GANT61与GANT61药物溶液的抑制效能无明显差异,靶向载药纳米粒rHDL-GANT61和tLyP-1-LNP-GANT61对三阴乳腺癌细胞SHH通路的抑制效能强于药物溶液和非靶向载药纳米粒,肽功能化重组高密度脂蛋白载药纳米粒tLyP-1-rHDL-GANT61对三阴乳腺癌细胞SHH通路抑制效能优于其他各个实验组。在划痕实验和Transwell实验中,我们观察到GANT61以及各组载药纳米粒可以抑制三阴乳腺癌细胞迁移、侵袭的能力,各个实验组间的结果差异趋势与SHH通路抑制的趋势类似,通过Western Blot实验我们观察到了上皮-间质转化相关指标的变化。通过HUVEC小管形成实验,我们发现GANT61以及各组载药纳米粒可以抑制MDA-MB-231和BT-549新生血管的能力。与之前结果一致的是,tLyP-1-rHDL-GANT61纳米粒的抑制效能最强,显著优于各个实验组,通过q RT-PCR实验我们观察到了新生血管相关分子VEGF-A、VEGFR2、THSBS1和s VEGFR2的变化。结论:在乳腺癌患者中GLI1的高表达可以导致更恶劣的预后,抑制GLI1可能是乳腺癌治疗的潜在靶点。GANT61对三阴乳腺癌细胞的GLI1有明确的抑制效应,肽功能化重组高密度脂蛋白载药纳米粒可以增强GANT61对乳腺癌细胞GLI1的抑制效能。并可以通过转录因子GLI1的抑制以调控多个下游靶点,抑制三阴乳腺癌细胞迁移、侵袭、血管新生等表型。第五部分肽功能化重组高密度脂蛋白纳米粒体内抗肿瘤效应的评估及其生物安全性评价目的:检测肽功能化重组高密度脂蛋白纳米粒在高转移性三阴乳腺癌动物模型中对肿瘤原发灶和肿瘤肺转移的抑制效能。评估肽功能化重组高密度脂蛋白纳米粒的生物安全性。方法:利用MDA-MB-231/LUC细胞,在重度免疫缺陷NCG鼠上构建高转移性三阴乳腺癌移植瘤模型。将小鼠分为8个治疗组,分别由尾静脉给予生理盐水、PTX溶液、GANT61溶液、PTX+GANT61混合溶液、LNP-PTX/GANT61纳米粒、rHDL-PTX/GANT61纳米粒、tLyP-1-LNP-PTX/GANT61纳米粒和tLyP-1-rHDL-PTX/GANT61纳米粒,记录肿瘤的生长曲线。并利用小动物活体成像系统检测NCG鼠肺转移灶LUC生物发光强度。在瘤体接种后第41天处死小鼠,收集瘤体并称重,进行HE染色、Ki-67免疫组化、TUNEL检测和CD31免疫组化。收集小鼠肺组织,Bouin’s液固定之后计数肺表面转移结节个数,并行HE染色。将健康的NCG鼠分为8组,按照上述相同方案进行给药,记录体重变化曲线,15天后行血常规、血生化指标检测,并处死小鼠行心、肝、脾、肺、肾等重要脏器HE染色。结果:PTX和GANT61的联合治疗可有效抑制肿瘤原发灶的生长,对比接受单药治疗的小鼠,接受PTX+GANT61联合药物溶液的小鼠的瘤体生长更加缓慢。非靶向载药纳米粒LNP-PTX/GANT61和PTX+GANT61对瘤体原发灶的抑制效没有明显差异。靶向载药纳米粒rHDL-PTX/GANT61、tLyP-1-LNP-PTX/GANT61的抗肿瘤效应进一步增强,双重靶向载药纳米粒tLyP-1-rHDL-PTX/GANT61对肿瘤原发灶的抑制作用最强且显著优于其余各实验组。Ki-67、TUNEL以及CD31染色结果可见双重靶向载药纳米粒组相对于对照组细胞增殖指数降低、凋亡指数升高、新生血管减少。肺转移灶LUC生物发光信号检测、肺表面转移瘤结节计数以及肺组织切片HE染色均提示PTX无法抑制肿瘤肺转移,GANT61可以减少肿瘤肺转移的发生,GANT61单独使用与PTX+GANT61的联合治疗以及非靶向载药纳米粒LNP-PTX/GANT61对肿瘤肺转移的抑制作用没明显差异。靶向载药纳米粒对肿瘤肺转移的抑制作用更强,tLyP-1-rHDL-PTX/GANT61对肺转移的抑制效能显著优于其余各实验组。在生物安全性评估实验中,接受PTX+GANT61药物溶液注射的健康NCG鼠的各个重要脏器可见不同程度的组织损伤,并主要集中在肝脏,且伴随血常规、血生化指标的异常。使用载药纳米粒可以使组织损伤减轻,双重靶向载药纳米粒组各个器官H&E染色结果亦未见明显病理学损伤。结论:在高转移性三阴乳腺癌移植瘤模型中,肽功能化重组高密度脂蛋白载药纳米粒tLyP-1-rHDL-PTX/GANT61可以显著抑制肿瘤原发灶的增殖且同时可以减少肿瘤肺转移的发生。除此之外,肽功能化重组高密度脂蛋白载药系统可以显著的减少抗肿瘤药物所产生的毒副作用,具有广阔的临床应用前景,tLyP-1-rHDL-PTX/GANT61有望成为一种有效高效的三阴乳腺癌治疗策略。