钉螺血蓝蛋白功能域的克隆与重组表达研究

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血吸虫病是一种人、畜共患的寄生虫病,我国是日本血吸虫病流行区。在日本血吸虫生活史中,钉螺(Oncomelania hupensis)是其唯一的中间宿主,日本血吸虫病的地理分布与钉螺的分布相吻合,因此控制钉螺的繁衍与传播是减少血吸虫病传播的有效手段。目前,化学灭螺是最常用的灭螺方法。广泛使用的氯硝柳胺、五氯酚钠等药物虽然能够有效杀灭钉螺,但存在药物使用量大,专一性差,对人和动物都有一定毒害等不足。因此,寻找一种特异性杀灭钉螺的药物具有重要意义。钉螺属于软体动物门钉螺属,是水陆两栖动物,常栖息于淡水水域。研究表明,钉螺的正常氧运输需要依靠一种细胞外的大分子蛋白质——血蓝蛋白(Hemocyanin, Hc),目前有关钉螺血蓝蛋白的研究报道较少。本文提取并纯化了湖北钉螺血蓝蛋白;克隆鉴定钉螺血蓝蛋白一功能域基因并在大肠杆菌中对其成功表达;另外,我们对该蛋白的结晶条件进行了筛选并成功获得了该蛋白的晶体;数据收集和结构解析等工作将为阐明血蓝蛋白的输氧机制和基本功能打下基础,也为探索发现潜在的专一性防治药物提供一定的依据。具体地,我们利用CODEHOP引物设计方法设计引物,克隆得到了钉螺血蓝蛋白基因,经NCBI网站BLAST软件比对分析,找到了钉螺血蓝蛋白的一个完整功能域,命名为P,大小约为1.3kb左右。设计引物,提取钉螺血蓝蛋白功能域P(Oncomelania hupensishemocyanin domain P, OhHP),OhHP基因通过BamHI和NdeI酶切位点插入表达载体pET28a,构建重组表达质粒OhHP-pET28a,酶切鉴定及序列测定表明,目的基因片段连接正确。将重组质粒转化到感受态大肠杆菌BL21(DE3)中,IPTG诱导表达目的蛋白,SDS-PAGE分析结果显示在47kD附近可见清晰条带,与预计大小相符。大量表达目的蛋白,依次采用Ni2+亲和层析及DEAE亲和层析对蛋白进行纯化,能够得到大量较纯的蛋白。将纯化好的蛋白浓缩到25mg/mL左右,采用悬滴蒸汽扩散法,对蛋白结晶条件进行筛选并成功找到适合该蛋白结晶的条件。目前蛋白晶体的X射线衍射数据收集和结构解析工作正在进行中。
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