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第一部分乙型肝炎病毒x基因的真核表达质粒pEGFP-HBx的构建目的构建乙型肝炎病毒x基因的真核表达质粒pEGFP-HBx并进行表达鉴定,为研究HBx蛋白诱导原发性肝细胞肝癌(HCC)发生和发展的潜在途径打下基础。方法1以pcDNA-Flag-HBx质粒为模板,用上游含EcoRI酶切位点,下游含Sail酶切位点的基因引物扩增HBx全长基因。扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳,在凝胶成像仪上观察凝胶电泳图谱。2将真核表达载体pIRES2-EGFP质粒与扩增产物分别用内切酶EcoRI和Sail双酶切。双酶切产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳,胶回收纯化目的基因片段后,用T4DNA ligase将HBx基因定向插入至PIRES2-EGFP载体中,构建重组质粒pEGFP-HBx=3将重组质粒pEGFP-HBx转化感受态细菌E.coli DH5a,用无内毒素质粒小提试剂盒提取质粒。将提取的重组质粒pEGFP-HBx用内切酶EcoRI和Sail双酶切鉴定及基因测序鉴定目的基因片段是否连接正确。4将测序正确的pEGFP-HBx质粒瞬时转染HepG2细胞,Western blot法及荧光显微镜观察转染后pEGFP-HBx在真核细胞内的表达。结果1HBx基因PCR扩增电泳结果：PCR扩增出大小约500bp左右的目的基因条带,与gene bank公布的HBxDNA片段大小相符,初步表明亚克隆片断是HBx基因片断。2重组质粒pEGFP-HBx双酶切鉴定：在凝胶电泳图谱上可见分别在约500bp及5.3kb处有一条清晰的目的基因条带,初步证实PCR扩增产物已正确插入PIRES2-EGFP载体中。3western blot检测重组质粒pEGFP-HBx在HepG2细胞中的表达情况：western blot检测结果显示在17KD分子量左右处出现一条强表达条带,符合HBx蛋白分子量大小,而对照组未见条带出现。4免疫荧光检测重组质粒pEGFP-HBx在HepG2细胞的表达：转染pEGFP-HBx的HepG2细胞被激发出绿色荧光,用激光共聚焦软件分析显示阳性细胞数,计算细胞转染率在30%左右,未转染细胞则无绿色荧光。结论HBx被成功克隆到PIRES2-EGFP载体上,HBx基因克隆及其真核表达载体pEGFP-HBx构建成功,重组质粒pEGFP-HBx在真核细胞HepG2中有较高的表达,为HBV相关性HCC发生发展的生物学研究奠定基础。第二部分HBx蛋白与SOCs通道蛋白作用机制的研究目的研究HBx蛋白与通透性钙池调节离子通道(SOCs)的通道蛋白Orai1和STIM1之间的相互作用机制,明确HBx蛋白在依赖钙池操纵钙离子通道调节细胞内游离钙离子水平的可能作用分子机制,为HBx在诱导SOCs产生增加肝细胞内钙离子浓度在肝细胞恶性转化中的作用打下基础。方法1HEK293细胞用含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基培养,待细胞生长至80%融合度进行传代或利用lip2000进行转染。2pcDNA-HBx质粒瞬时转染HEK293细胞24h后,在倒置显微镜下观察转染后HEK293细胞的生长状态。24h后收集细胞蛋白,western blot检测HBx在HEK293细胞内的表达情况。3利用HEK293细胞容易培养,且有很高的转染率的特性,将HA标记的Orai1基因和STIM1基因及Flag标记的HBx基因分别共转染HEK293细胞,使用Flag-beeds免疫沉淀HBx蛋白,westernblot检测Orai1蛋白或STM1蛋白的表达,反之,使用HA-beeds免疫沉淀Orai1蛋白或STEM1蛋白,westernblot检测HBx蛋白的表达。4将pEGFP-HBx和pcDNA-HA-Orail质粒共转染细胞,用CY3标记的HA多克隆抗体标记Orai1蛋白,在激光共聚焦显微镜下观察在细胞内HBx蛋白与Orai1蛋白的定位。5为进一步明确HBx蛋白与Oria1蛋白相互作用位点,运用GST沉降技术分别将GST融合蛋白GST-Orai1、GST-Orail-C-termina1、GST-Orail-loop及GST-Orai1-N-terminal与HBx蛋白进行GST pull-down试验。结果1倒置显微镜下观察HEK293细胞生长状态：转染24h后,HEK293细胞呈多角形、半透明状,胞体饱满,细胞生长良好。2western blot检测HBx基因在HEK293细胞中的表达：可见在HBx蛋白分子量(17KD)大小处出现强表达条带,而对照组无条带出现。3Co-IP检测体内HBx与SOCs通道蛋白的相互作用情况：HBx蛋白与Orai1发生免疫共沉淀,而HBx蛋白却不与STIM1发生免疫共沉淀,阴性对照组无免疫共沉淀发生。4免疫荧光检测HBx蛋白与Orai1在细胞内定位：在共聚焦显微镜下,HBx蛋白发绿色荧光的融合蛋白,主要在细胞浆内表达,细胞核也有少量表达。Orail蛋白发红色荧光,主要在细胞膜表达。HBx蛋白与Orai1蛋白相结合的细胞发黄色荧光,主要在细胞膜和胞浆内结合。5GST pull-down试验检测HBx蛋白与Orai1的结合位点：结果显示在细胞外Orai1全长及Orai1-C-terminal (257-301aa)可以特异性地和HBx结合,然而Orai1-loop(1-71aa)及Orai1-N-terminal(141-173aa)却不与HBx蛋白相结合,阴性对照组无结合。结论转染pcDNA-HBx质粒的HEK293细胞生长状态良好,HBx基因可在HEK293细胞中表达,并且呈高表达状态。HBx蛋白与STIM1蛋白之间并不能直接结合,而是通过与细胞膜钙离子通道蛋白Orai1蛋白C末端(Orail-CT)相互结合,并定位在细胞膜和胞浆内,诱导SOC产生,增加细胞内钙离子浓度,促进肝细胞恶性转化。第三部分HBx通过与Orai1作用升高肝细胞内钙离子浓度的机制研究目的研究HBx蛋白通过与Orai1的作用对肝细胞依赖钙池操纵钙离子通道的钙内流的影响,明确HBx蛋白升高肝细胞内游离钙离子可能的作用机制,并研究HBx蛋白诱导的肝细胞钙超载对肝细胞增殖的影响,揭示HBx蛋白在肝细胞恶性转化中的作用。方法1HepG2细胞用含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基培养,待细胞生长至80%融合度进行传代或利用lip2000进行转染。2用GdCl3与荧光探针Fura-2-AM共同孵育HepG2细胞后,先用EGTA螯合细胞外液游离的钙离子,再加入含有毒胡萝卜素及EGTA的无钙HBSS,刺激细胞内钙池的钙离子释放,然后加入Ca2+,使钙池操纵钙离子内流(SOC)产生,用钙离子荧光影像系统检测Gd3+干预对肝细胞内钙离子浓度影响,并设不加GdCl3组为空白对照组。3将pEGFP-HBx质粒转染HepG2细胞,加入荧光探针Fura-2-AM孵育后,先用EGTA螯合游离的钙离子,再用毒胡萝卜素刺激细胞内钙池钙离子释放,排空钙池内钙离子,然后加入Ca2+,使胞外钙离子内流,产生SOC,用钙离子荧光影像系统检测HBx对肝细胞内钙离子浓度影响,并设未转染组做空白对照。4将pcDNA-HA-Orai1及pcDNA-HA-STIM1质粒共转染HepG2细胞,并设未转染组做空白对照,观察SOCs通道蛋白Orai1蛋白和STIM1蛋白的过表达对肝细胞内钙离子浓度的影响。5将pEGFP-HBx与pcDNA-HA-Orai1质粒共转染HepG2细胞,观察在HepG2细胞中HBx蛋白通过与Orai1蛋白相互作用对肝细胞内钙离子浓度的影响,并设单独转染pEGFP-HBx质粒组做对照。6将pEGFP-HBx、pcDNA-HA-Orai1及pcDNA-HA-STIM1质粒共转染HepG2细胞,设共转染pcDNA-HA-Orai1和pcDNA-HA-STIM1质粒的HepG2细胞做对照,观察HBx蛋白通过与SOCs通道蛋白的相互作用对肝细胞内钙离子浓度的影响。7将pcDNA-Flag-HBx瞬时转染生长状态良好的HepG2细胞,显微镜下观察细胞生长状态,用细胞毒性/增殖检测试剂CCk8观察HepG2细胞在转染后Oh,12h,24h,48h的细胞活性。并设未转染组为空白对照组。结果1Gd3+干预对HepG2细胞钙离子浓度影响：Gd3+干预组细胞内钙离子浓度出现轻度升高,钙内流不明显,而对照组细胞内钙离子浓度迅速显著升高(p<0.001)。2HBx蛋白对HepG2细胞钙离子浓度的影响：pEGFP-HBx质粒转染组与空白对照组相比较,胞外钙离子内流更加明显,细胞内钙离子浓度显著增加(P<0.05)。3SOCs通道蛋白对HepG2细胞钙离子浓度的影响：Orai1和STIM1过表达能增加胞外钙离子内流,细胞内钙离子浓度明显增加(P<0.001)。4HBx蛋白通过与Orai1作用对HepG2细胞钙离子浓度的影响：共转染HBx基因与Orai1基因组胞外钙离子内流较只转染HBx基因组增加,可以明显增加细胞内钙离子浓度(P<0.05)。5HBx蛋白与SOCs通道蛋白作用对HepG2细胞钙离子浓度的影响：实验组胞外钙离子内流幅度较对照组明显增加,可以显著增加细胞内钙离子浓度(P<0.005)。6在转染pcDNA-Flag-HBx质粒24h,48h后,实验组吸光度值与对照组相比均明显增高,P<0.05。结论HBx蛋白通过与Orai1的C末端相互作用,进而促进Orai1与STIM1作用,激活SOCs通道,增加钙内流,引起细胞内钙离子浓度失衡,进而使肝细胞增殖加快。