背景原发性视网膜色素变性(retinitis pigmentosa；RP)是视网膜感光细胞和色素上皮细胞变性导致夜盲和进行性视野缺损的一组最常见遗传性致盲眼底病。群体患病率在不同的种族人群中较为相似，约l／3500-4000。患者典型的临床病程为早期出现夜盲，随后周围视野呈进行性的缺失，后期由于变性累及视锥细胞而导致中央视野丢失。目前尚无有效的治疗手段可阻止RP病程的发展。RP是单基因遗传病，在遗传和表型上均具有较大的异质性。随着连锁定位分析及突变检测技术在RP遗传基因研究中的应用，人们对该病分子发病机理的探讨已取得了突破性的进展。至今已发现至少31个染色体位点与不同遗传类型的RP疾病紧密连锁，而且至少在其中的15个基因上找到了致病突变。其中致病人数最多的基因为视紫红质(rhodopsin，RHO)基因，其突变在美国RP患者中的发生率约10％。在至今已报道的近100种RHO基因突变中，P347L，是最常见的RP致病突变，它在北美、欧洲、亚洲及非洲adRP患者中的发生率基本相似，约3％一5％，而在所有类型RP患者中的发生率则约为0．5％．1．O％。1999年Pierce等和Sullivan等用不同的方法同时找到了一新的视网膜感光细胞特异基因，RPl。突变研究至今已在白种人中找到了20多种致病突变，其在adRP患者中的发生率约为7％，在所有类型RP患者中的发生率则约为3％，仅次于RHO基因。其中较常见的R677X在美国及欧洲地区adRjRP患者中的检出率约为3％。目前关于RPl蛋白的功能还不十分清楚。 目的 目前RP的分子遗传学研究还主要集中在白种人群，亚洲人群的研究报道主要来自于日本，而有关中国人RP基因突变的系统研究几乎没有。为了解RHO和RPl这两个目前突变频率相对较高的RP基因在中国RP患者中的突变情况及其在RP发病机制中所起的作用，我们对收集到的100例中国人RP患者和190例正常对照进行了两基因全编码区突变的筛选与检测，并尝试在此基础上建立起一套快速而准确的突变检测分析系统，以常规地运用于RP的基因诊断与遗传咨询。 方法 运用多聚酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)，构象敏感凝胶电泳(conformation sensitive gel electrophoresis，CSGE)和PCR产物直接测序方法对100例中国RP先证者RHO和RPl基因全编码区及其邻近拚接位点进行了突变的筛选与检测.对照组为190例健康成年人，以确定所检测到的变异是否系RHO和RPl基因的多态现象。对部分怀疑携带有RHO及RPl基因致病突变的RP先证者，我们对收集到的其一级或二级家庭成员也做了相应的基因分型，以确认该突变在其家系中是否垂直传递。此外，为进一步增加CSGE凝胶的分析样本量，加快突变的检测速度，以更好地适应RP基因诊断中同时对多个致病基因进行大规模突变筛选检测的需要，我们对现有的CSGE操作程序做了尝试性的改进。 结果在RHO基因上，研究共发现6种碱基变异，其中3种为沉默型突变，2种为错义突变，1种<WP=9>为缺失突变。P347L在1名55岁女性患者及其同样患RP的3名子女中检出。P327(1．bp del)首次在1名53岁的晚发型RP患者中发现，其26岁的女儿同样携带该突变，虽然目前还没有RP的典型症状，但其眼底观察色素上皮已出现斑点，并且ERG杆、锥体反应已略显下降。上述两种突变均未在正常对照组中发现。A299S和另外3种沉默型突变分别同时在RP患者及对照组成员中检出，系RHO基因的多态现象。 在RP1基因上，研究共发现2个无义突变和8个错义突变。除R249H和M479I 2个点突变外，其余6个错义突变均在正常对照组中检出，系RPl基因的多态现象。R249H在一例RP患者中检出，但其同样患有RP的女儿却未携带此错义突变，而M479I同时在一名66岁的RP患者及其30岁的儿子中发现，但其儿子却没有．RP的任何症状或体征，表明R249H与M479I同RP疾病均未出现"共分离"现象，因此不大可能是RP致病突变。RPl常见的致病突变．R677X在一例RP患者中检出，突变可能最终导致RPl蛋白严重截短。另外，在3名正常个体及一名Stargardt患者中检出可能是目前首例非致病的RPl无义突变．R1933X。 经改进的CSGE凝胶一行有96个加样孔，通过间隔30min分批加样7次，每块CSGE凝胶一次可分析的样本量可达672个(96×7)。如果电泳8．5h，平均每一分钟便可筛选1．3个样本(672／8．5×60)。含杂合型单碱基变异的样本经凝胶电泳8．5h后呈现双带型，而野生型的样本只产生一条带。由于胶的厚度变薄，分析样本的量减少以及采用SYBRGold染色，从而提高了条带的分辨率。结论本研究在100例RP患者中发现2例RHO基因第327、347密码子存在致病突变，由此可预测RHO基因在中国人RP患者中的突变率低于7．O％(2／100=2．0％，95％的可信区间为0．2％-7．0％)，相比于美国白种人中的报道较低，但这只是初步的评估，更完善的资料和数据有待在更广泛的RHO基因分型中获得。P347[，突变改变了RHO基因C末端一段高度保守的氨基酸序列，致使视紫红质蛋白在胞内的运输发生障碍。P327(1．bp del)使突变蛋白的羧基末端失去了原有的磷酸化位点及一段高度保守的功能区，其可能的致病机理有待在今后的研究中通过建立相应的转基因模型或细胞培养系统来阐明。此外，本研究还发现了迄今为止第三个非致病的