脱落酸（abscisic acid,ABA）是一种重要的植物激素,调节植物生长发育,增强植物抗逆性。在ABA信号通路中,蔗糖非发酵1（SNF1）相关蛋白激酶2家族（Sucrose Nonfermenting 1（SNF1）-related Protein Kinase 2s,SnRK2s）家族蛋白是ABA信号传导的关键组分,其中Open Stomata 1（OST1）/SnRK2.6调控ABA依赖的气孔闭合。硫化氢（hydrogen sulfide,H₂S）是一种小分子气态信号物质,参与植物多种生理生化反应,促进气孔闭合、增强光合作用和缓解干旱胁迫等。H₂S介导的蛋白翻译后修饰是S-硫巯基化,S-硫巯基化修饰是H₂S参与调控蛋白活性的主要方式。目前已有研究表明H₂S参与ABA诱导的气孔闭合。本研究证明ABA信号通路诱导气孔闭合的关键激酶蛋白SnRK2.6存在S-硫巯基化修饰,并以SnRK2.6激酶蛋白的翻译后修饰调控为切入点,阐明H₂S介导的S-硫巯基修饰参与调节SnRK2.6活性促进ABA诱导的气孔闭合分子机制。取得的结果如下所示:（1）通过原核表达获得SnRK2.6体外重组蛋白。利用液质联用仪（LC-MS）对SnRK2.6重组蛋白进行蛋白质修饰分析,发现在第131号和第137号的半胱氨酸残基（Cys131和Cys137）存在S-硫巯基修饰。利用SnRK2.6蛋白结构信息和SnRK2.6重组蛋白的质谱分析数据,构建SnRK2.6蛋白的3D模型。结果表明Cys131和Cys137处于SnRK2.6蛋白表面,同时与激酶关键磷酸化位点Ser175相邻。（2）改良生物素转化法（Modified biotin switch method,MBSM）证明,用H₂S供体硫氢化钠（Na HS）处理SnRK2.6重组蛋白与野生型拟南芥和S-硫巯基化位点突变遗传株系ost1-3/SnRK2.6^{C131SC137S-GFP},可以提高SnRK2.6硫巯基修饰水平增强,并存在计量依赖的调控效应。证明H₂S可以在体内外均可调控SnRK2.6硫巯基修饰水平。（3）磷酸化抗体检测激酶活性,发现Na HS处理可以诱导SnRK2.6酶活性,并存在计量依赖的调控效应,证明H₂S可以促进SnRK2.6激酶活性。（4）构建去硫巯基的SnRK2.6突变体蛋白,即把目标半胱氨酸位点（Cys131和Cys137）突变为丝氨酸（Ser,S）。对突变体蛋白SnRK2.6^C137S,SnRK2.6^C131S和SnRK2.6^C131SC137S进行激酶活性检测,发现和SnRK2.6^WT相比突变蛋白酶活性显著下降。双点突变体蛋白SnRK2.6^C131SC137S激酶活性下降的最显著,其次是SnRK2.6^C137S。SnRK2.6^C131S活性少量下调。以上结果表明,Cys137是最关键的硫巯基化调控位点。（5）通过双分子荧光互补（Bimolecular Fluorescence Complementation,Bi FC）实验检测硫巯基化修饰对SnRK2.6与下游转录因子ABA响应因子2（ABA response element-binding factor2,ABF2）互作的影响。发现Na HS处理可以显著增强互补荧光强度,SnRK2.6去硫巯基化突变体与ABF2互补荧光强度减弱。通过Pull-down实验进一步验证硫巯基化修饰对SnRK2.6与ABF2互作的影响。结果发现,硫巯基化修饰增强SnRK2.6与底物的互作,去巯基化修饰削弱SnRK2.6与底物的互作。（6）以拟南芥SnRK2.6基因敲除突变体ost1-3为背景,本研究构建了回补和一系列S-硫巯基化位点突变遗传株系ost1-3/SnRK2.6^WT-GFP,ost1-3/SnRK2.6^C131S-GFP,ost1-3/SnRK2.6^C137-GFP和ost1-3/SnRK2.6^{C131SC137S-GFP}。从生理水平对气孔导度,叶片失水速率,植株耐旱性以及保卫细胞中H₂S含量进行了检测。ABA能提高保卫细胞H₂S的含量,促进ABA诱导的气孔闭合,提高植物对抗旱的防御能力。ost1-3/SnRK2.6^C131S-GFP,ost1-3/SnRK2.6^C137-GFP和ost1-3/SnRK2.6^{C131SC137S-GFP}点突变遗传株系对ABA诱导的气孔闭敏感度下降,叶片失水速率升高,植物抗旱能力减弱。这些结果表明,ABA能诱导保卫细胞中H₂S的产生,提高SnRK2.6的S-硫巯基化修饰,促进ABA诱导的气孔闭合。（7）以本研究构建的一系列硫巯基化位点突变体遗传株系为材料,具体见（6）所述。采用钙离子荧光探针（Fluo-3AM）和非损伤微测技术（Non-invasive Micro-test Technique,NMT）,对保卫细胞中胞质钙[Ca²⁺]_cyt含量和Ca²⁺通量进行了检测。发现ABA和H₂S都能提高保卫细胞中Ca²⁺的含量,促进保卫细胞的Ca²⁺内流。ost1-3/SnRK2.6^C131S-GFP,ost1-3/SnRK2.6^C137-GFP和ost1-3/SnRK2.6^{C131SC137S-GFP}点突变遗传株系对ABA和H₂S诱导Ca²⁺内流的敏感度下降。结果表明SnRK2.6的S-硫巯基化修饰促进保卫细胞Ca²⁺的内流,去巯基化修饰削弱保卫细胞Ca²⁺的内流。证明H₂S调节了保卫细胞中ABA诱导的Ca²⁺信号传导通过SnRK2.6的S-硫巯基化作用。