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[目 的]胃癌是消化道中最常见的恶性肿瘤之一。其生物学行为涉及到肿瘤细胞增殖浸润、血性转移、淋巴转移等。从细胞层面看,肿瘤细胞有别于正常细胞的异常生物合成和物质代谢水平与肿瘤增殖能力和侵袭力相关,肿瘤微环境中各类细胞的代谢产物和炎症因子对于调节肿瘤细胞和免疫细胞活性至关重要。细胞内的物质代谢水平的波动可能会对肿瘤的进展造成促进或是抑制作用。肿瘤发展常常伴有慢性炎症的发生,而慢性炎症会刺激诱导型一氧化氮合酶（iNOS）的表达增加,催化产生NO、H2O2、O2-等产物导致氧化应激状态,在这一反应中四氢生物喋呤（BH4）是辅助iNOS发挥活性的重要因子,其浓度直接影响iNOS还原酶亚基与氧化酶亚基之间的耦合或去耦合,从而影响代谢产物,改变氧化应激平衡。此外,BH4作为氧化磷酸化过程中的重要中间体,对于细胞的能量代谢、自噬、凋亡等方面也有重要意义。体内BH4从头合成途径的相关酶包括GTP环氧水合酶-1（GCH-1）、丙酮酰四氢喋呤合成酶（PTS）以及墨喋呤还原酶（SPR）,其中限速酶是GTP环氧水合酶-1（GCH-1）,通过调控GCH-1导致体内BH4水平变化,能够导致肿瘤微环境的变化并影响肿瘤的发展。本研究通过慢病毒转染使胃癌细胞株过表达GCH-1进行体外实验,以转染细胞及非转染细胞分别建立BALB/c-nu小鼠荷瘤模型,并通过予以GCH-1特异性抑制剂DAHP进行体内实验,通过PCR、Western blot、ELISA、Griess试剂法等检测技术进行以下研究:①通过转染GCH-1过表达慢病毒载体使胃癌细胞株过表达GCH-1,增加细胞内源性BH4水平,促进NO的合成;②探究BALB/c-nu小鼠荷瘤模型肿瘤组织内BH4及其合成通路相关蛋白以及NO水平与肿瘤进展的关系,并探索其可能的机制,有望为胃癌诊疗提供新的思路和靶点。[方 法]1、无菌细胞培养技术培养MKN-45、SGC7901、MGC803等三株胃癌细胞,通过PCR筛选其GCH-1表达水平较低的胃癌细胞株,通过慢病毒载体转染使其稳定过表达GCH-1基因。2、通过PCR和Western blot实验评估转染细胞株及同系非转染细胞株GCH-1表达情况,同时采用ELISA法测定BH4水平、Griess试剂法测定NO水平。3、培养足够数量的慢病毒转染胃癌细胞及同系非转染细胞,将30只2-5周龄BALB/c-nu小鼠通过随机数表法分为转染组（n=20）和非转染组（n=10）,分别皮下注射转染及非转染肿瘤细胞建立BALB/c-nu小鼠的人胃癌细胞株荷瘤模型,再经随机数表法将转染组20只小鼠分为两个亚组,即转染Saline组（n=10）、转染DAHP组（n=10）,转染DAHP组给予DAHP（80mg/kg/天）腹腔注射处理,转染Saline组和非转染（即非转染Saline组）组给予等体积生理盐水腹腔注射,处理三周后脱颈椎处死小鼠,剥取肿瘤组织,测量并记录肿瘤长径（A）以及短径（B）,通过公式V=0.5×A×B2计算小鼠肿瘤体积,比较转染Saline组和非转染Saline组以及转染Saline组和转染DAHP组之间的差异。4、用ELISA法测定各组肿瘤组织中BH4的浓度,分别对转染Saline组和非转染Saline组以及转染Saline组和转染DAHP组肿瘤组织中BH4浓度进行差异比较。5、用Griess试剂法测定各组肿瘤组织中NO的浓度,分别对转染Saline组和非转染Saline组以及转染Saline组和转染DAHP组肿瘤组织中NO浓度进行差异比较。6、用PCR技术定量检测各组肿瘤组织中GCH-1、PTS、SPR基因相对表达量,分别对转染Saline组和非转染Saline组以及转染Saline组和转染DAHP组中上述基因表达量进行比较。7、用Western lot法检测各组肿瘤组织中GCH-1、PTS、SPR蛋白表达情况,通过ImageJ分析蛋白灰度值,以内参蛋白（GAPDH）作为参照,计算出各组目的蛋白与内参蛋白灰度值的比值,即为目标蛋白的相对表达量,分别对转染Saline组和非转染Saline组以及转染Saline组和转染DAHP组中上述蛋白的相对表达量进行比较。[结 果]1、通过PCR筛选胃癌细胞株,MGC803细胞系GCH-1表达呈低表达,选择MGC803作为实验细胞株进行转染。2、以非转染MGC803细胞株作为对照（即1）,PCR结果显示转染后MGC803细胞株GCH-1、PTS、SPR表达均增高。3、Western blot结果表明,转染后MGC803细胞株GCH-1、PTS、SPR蛋白表达均较非转染MGC803细胞株增高。4、ELISA法测定各组BH4浓度,结果显示MGC803转染组BH4水平高于非转染 MGC803 组（234.60±23.74ng/LVs 172.21±18.59ng/L,t=-4.627,p=0.002）,差异具有统计学意义。5、Griess试剂法测定细胞NO浓度,结果显示MGC803转染组NO水平高于非转染 MGC803 组（9.17±1.71 μ mol/gprot Vs 7.82±1.78 μ mol/gprot,t’=-2.313,p=0.027）,差异具有统计学意义。6、BALB/c-nu小鼠移植瘤取材后分析,非转染Saline组肿瘤较转染Saline组增大（309.19±105.14mm3 Vs 179.40±81.79mm3,t=3.081,p=0.006）,转染DAHP组肿瘤较转染 Saline 组增大（301.59±105.06mm3 Vs 179.40±81.79mm3,t=2.902,p=0.009）,以上差异均有统计学意义。7、ELISA法检测小鼠肿瘤组织BH4水平,转染Saline组中BH4含量高于非转染 Saline 组（287.36±14.54ng/LVs 231.53±19.51ng/L,t=-7.255,p<0.001）;转染 Saline 组中 BH4 含量高于转染 DAHP 组（287.36±14.54ng/L Vs 223.92±16.74ng/L,t=9.049,p<0.001）,以上差异均有统计学意义。8、Griess试剂法测定小鼠肿瘤组织NO浓度,转染Saline组中NO浓度高于非转染 Saline 组（9.02±3.85 μ mol/gprot Vs 3.11±1.34 μ mol/gprot,t=4.591,p<0.001）;转染Saline组中NO高于转染DAHP组（9.02±3.85 μ mol/gprot Vs 6.01±2.22 μmol/gprot,t=2.144,p=0.046）,以上差异均有统计学意义。9、采用PCR法测定各组小鼠肿瘤组织中GCH-1、PTS、SPR通路基因mRNA转录情况,结果表明,以非转染Saline组作为对照（即1）,转染Saline组小鼠肿瘤组织中GCH-1、PTS、SPR基因表达水平均高于非转染Saline组（GCH-1:1.87±0.25 Vs 1.00±0.08,t=10.450,p<0.001;PTS:1.63±0.15 Vs 1.00±0.07,t’=11.843,p＜0.001;SPR:1.79±0.16Vs 1.00±0.06,t’=14.722,p<0.001）;以转染S aline组作为对照（即1）,转染Saline组小鼠肿瘤组织中GCH-1、PTS、SPR基因表达水平均高于转染DAHP组（GCH-1:1.01±0.14 Vs 0.55±0.11,t=8.382,p<0.001;PTS:1.00±0.09 Vs 0.59±0.05,t=12.511,＜0.001;SPR:1.00±0.09Vs 0.55±0.05,t=14.092,p<0.001）。以上差异均有统计学意义。。10、采用Western blot法测定各组BALB/c-nu小鼠肿瘤组织内GCH-1、PTS及SPR蛋白表达情况,结果表明,转染Saline组小鼠肿瘤组织中GCH-1、PTS、SPR蛋白表达水平均高于非转染Saline组（GCH-1:0.87±0.12 Vs 0.63±0.15,t=3.999,P=0.001;PTS:0.66±0.14Vs 0.47±0.09,t’=3.531,p=0.002;SPR:0.99±0.11 Vs 0.78±0.09,t=4.518,p<0.001）;转染Saline组小鼠肿瘤组织中GCH-1、PTS、SPR蛋白表达水平均高于转染DAHP组（GCH-1:0.87±0.12Vs 0.48±0.17,t=5.905,p<0.001;PTS:0.66±0.14Vs 0.32±0.11,t=5.919,p＜0.001;SPR:0.99±0.11 Vs 0.67±0.18,t=4.820,p<0.001）。以上差异均有统计学意义。[结 论]GCH-1过表达可抑制胃腺癌MGC803 BALB/c-nu荷瘤小鼠肿瘤增长,其机制与GCH-1过表达引起其下游PTS、SPR表达增加,促进BH4合成,BH4促进iNOS亚基间耦合而促进肿瘤组织NO的合成有关。