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[目的]MiR-301b-3p是近年来新发现的miRNA,已被证实能作为致癌因子参与肺癌的发生发展,但miR-301b-3p对肺癌细胞恶性生物学行为的影响及其潜在作用机制尚不完全清楚。本研究旨在探讨miR-301b-3p对肺癌细胞增殖、克隆形成、迁移、侵袭能力的影响以及验证miR-301b-3p与靶基因CYLD、miR-301b-3p与PTEN/MAPK通路的相关性,以期为肺癌临床治疗提供新的分子靶点。[方法]1、采用RT-qPCR技术检测非小细胞肺癌细胞株miR-301b-3p的表达水平。2、分别转染miR-301b-3p inhibitor、inhibitor NC至非小细胞肺癌细胞株H460及H460SM,并设立三个并行组,转染miR-301b-3p inhibitor的肺癌细胞为实验组,转染inhibitor NC的肺癌细胞为阴性对照组,不做任何处理的肺癌细胞为空白对照组。转染后24h,通过细胞增殖实验、划痕实验、克隆实验、侵袭实验研究抑制miR-301b-3p的表达对肺癌细胞恶性生物学行为的影响。3、通过生物信息学数据库TargetScan及相关文献,初步筛选出与miR-301b-3p相关性较大的 6 个候选基因 PTEN、LRIG1、CYLD、NDRG2、VGLL4、EGR1。随后采用RT-qPCR技术检测miR-301b-3p inhibitor瞬时转染后细胞中PTEN、LRIG1、CYLD、NDRG2、VGLL4、EGR1 的表达水平,选取与 miR-301b-3p相关性最高的靶基因进行后续实验。4、采用Western blot验证miR-301b-3p与靶基因蛋白表达及相关通路的相关性。5、使用GraphPad Prism8、Image J和SPSS 26.0软件对实验结果进行处理和统计学分析。独立样本t检验用于两样本均数的比较,单因素方差分析用于多个样本均数间各均数的两两比较,实验数据用平均数±标准差（x±s）表示。P<0.05为差异有统计学意义。[结果]1、与人正常肺上皮细胞BEAS-2B相比,miR-301b-3p在非小细胞肺癌细胞株H460及H460SM中显著高表达,因此选择H460及H460SM细胞进行后续miRNA干扰实验。2、CCK-8法测定细胞增殖活力结果显示,与inhibitor NC组和空白对照组相比,miR-301b-3p inhibitor组H460及H460SM细胞的增殖能力显著降低（P<0.05）。3、细胞划痕实验:H460细胞组:inhibitor NC组与空白对照组相比,细胞迁移能力差异无统计学意义（P>0.05）;在抑制miR-301b-3p表达后,实验组细胞迁移能力均显著低于NC组和空白对照组（P<0.05）。H460SM细胞组:inhibitor NC组与空白对照组相比,细胞迁移能力差异无统计学意义（P>0.05）;在抑制miR-301b-3p表达后,实验组细胞迁移能力均显著低于NC组和空白对照组（P<0.05）。4、Transwell侵袭实验:H460细胞组:inhibitor NC组与空白对照组相比,细胞穿膜数差异无统计学意义（P>0.05）。在敲低miR-301b-3p后,miR-301b-3pinhibitor组细胞穿膜数均明显低于NC组和空白对照组（P<0.05）。H460SM细胞组:inhibitor NC组与空白对照组相比,细胞穿膜数差异无统计学意义（P>0.05）。在敲低miR-301b-3p表达后,miR-301b-3p inhibitor组细胞穿膜数均明显低于NC组和空白对照组（P<0.05）。5、克隆实验:H460细胞组:inhibitor NC组与空白对照组相比,细胞克隆形成率差异无统计学意义（P>0.05）。在敲低miR-301b-3p表达后,实验组细胞的细胞克隆形成能力显著低于NC组和空白对照组（P<0.05）。H460SM细胞组:inhibitor NC组与空白对照组相比,细胞克隆形成率差异无统计学意义（P>0.05）。在敲低miR-301b-3p表达后,实验组细胞的细胞克隆形成能力显著低于NC组和空白对照组（P<0.05）。6、在H460及H460SM细胞中,抑癌因子PTEN和CYLD的mRNA水平在miR-301b-3p敲低组中明显升高,与对照组相比差异具有统计学意义（P<0.05）。7、抑制细胞中miR-301b-3p的表达后,CYLD、PTEN蛋白显著上调,MAPK磷酸化水平降低而不同处理组MAPK总蛋白表达水平差异无统计学意义（P>0.05）。[结论]miR-301b-3p在肺癌中扮演致癌因子的角色,可能通过调控PTEN/MAPK信号通路及靶向CYLD影响肺癌细胞的恶性生物学行为。