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恶性肿瘤是严重危害人类健康的公共卫生问题,其发生发展是遗传和环境因素综合作用的结果,找寻有效的遗传生物学标志,做到早期预防和合理治疗,对于提高恶性肿瘤的生存率和生存质量具有重要意义。
环境致癌因子暴露所致的DNA损伤被认为是引起多阶段癌变过程的起始动力,不同个体内DNA修复酶活性的差异影响个体对环境致癌物所致DNA损伤的修复,在恶性肿瘤的遗传易感性中占据了核心地位。苯并(a)芘(BaP)作为一种主要的多环芳烃类(PAHs)环境化学致癌污染物,由煤、烟草和其它一些有机化合物高温加热或燃烧不完全时产生。7,8-二羟-9,10-环氧苯并芘(benzo(a)pyrene-7,8-dihydrodiol-9,10-epocide,BPDE)是苯并(a)芘在体内经微粒体酶代谢活化后生成的终致癌物,其中反式BPDE是代谢产物中活性最强的,具有亲电性碳原子活性基团,能与核酸和氨基酸中亲核基团共价结合形成加合物,损伤生物大分子的结构和功能,可导致碱基突变、缺失、插入、交联、甚至是DNA断裂等后果,这成为体细胞突变化学致癌机制的分子基础。
DNA修复基因是与肿瘤相关的首要环境应答基因。核苷酸切除修复NER是DNA损伤修复系统中最重要而灵活的一种,对多种DNA双螺旋损伤变性,如多环芳烃、铂类介导的DNA加合物,NER发挥主要的切除修复作用,而该通路的DNA修复酶多态将决定个体的DNA修复能力,成为肿瘤易感及化学治疗个体差异的主要原因。
核苷酸切除修复交叉互补基因1(excision repair cross complementation group 1,ERCC1)在NER过程中发挥着重要作用,位于19q13-3,ERCC1基因编码的核蛋白,具有结构特异性核酸内切酶活性,在双链DNA交界边缘酶促5裂解,以切除损伤的寡核苷酸。许多肿瘤病例对照研究和预后生存分析发现ERCC1基因多态性可影响NER系统的DNA损伤修复能力,与肿瘤发生发展及预后治疗关系密切。ERCC1基因存在着两个常见的SNPs:一个位于118密码子的Asn118Asn(rs11615);另一个多态C8092A(rs3212986)位于ERCC13非编码区。近年来ERCC1基因多态性相关研究颇受关注,但迄今尚无明确结论,详细机制仍有待进一步阐明。
本研究以780例沈阳地区健康汉族人群为研究对象,通过高效液相色谱精确定量的体外培养淋巴细胞与BaP作用产生的BPDE-DNA加合物水平和改良彗星试验评价的BaP所致DNA损伤来衡量个体DNA损伤修复能力,同时检测ERCClAsn118Asn(rs11615),C8092A(rs3212986)SNP位点基因型、单体型,并分析ERCC1及其相邻基因CAST的表达水平,试图探讨环境致癌因子所致DNA损伤修复能力的个体差异与ERCC1基因多态及其表达的关联,找寻意义确切的肿瘤关联性生物标志,进而试图阐明基因.基因、基因-环境间的交互作用及其机制,为NER通路肿瘤关联性生物标志的研究提供科学依据。
研究方法：
1.研究对象的确定
从2010年10月至2011年5月,收集来自沈阳市第九人民医院体检中心的中国汉族成年健康人群780例,填写简单调查问卷:记录人口学特征、既往病史、家族史及生活方式(吸烟、饮酒)等一般状况。研究对象排除肿瘤、遗传性疾病、放化疗、重度感染等疾病。告知研究对象并签署知情同意书后实施研究计划。
2.血液样品采集
每一研究对象平稳采集8ml外周静脉血样:其中6ml抗凝用于外周血淋巴细胞分离;2ml抗凝用于常规提取DNA。
3.淋巴细胞DNA损伤修复能力的评定
3.1BPDE-DNA加合物水平测定(高效液相色谱法);
3.2BaP所致DNA损伤测定(改良彗星试验)。
4.ERCC1基因多态性的分析
4.1TaqMan实时定量PCR测定ERCC1 Asn118Asn(rs11615),C8092A(rS3212986)SNP位点基因型:
4.2ERCC1 SNP基因型在人群中的分布频率;
4.3ERCC1 SNP位点的连锁不平衡性分析,并确定单体型;
4.4DNA修复能力与ERCC1候选SNP及单体型的关联分析。
5.ERCC1和CAST基因表达水平的分析
5.1实时定量PCR测定BPDE染毒后ERCC1 mRNA表达水平;
5.2实时定量PCR测定BPDE染毒后CAST mRNA表达水平;
5.3分析个体DNA损伤修复能力与ERCC1、CAST基因表达的关联。
6.BPDE-DNA加合物损伤修复的多因素分析
结果：
1.ERCC1基因多态在人群中的分布频率及单体型分析
ERCC1 C19007T和C8092A两个SNP位点存在明显的连锁不平衡(D=0.940,R2=0.134)。同时两者的基因频率符合Hardy-Weinberg平衡定律。
2.HPLC检测淋巴细胞BPDE-DNA加合物水平的相关分析
2.1BPDE-DNA加合物含量与性别、年龄、饮酒、吸烟情况之间的关系50-69岁和≥70岁年龄组人群淋巴细胞中BPDE-DNA加合物含量升高,差别具有统计学意义(P＜0.05)。与无饮酒吸烟史(饮酒指数或吸烟指数为1)的人群相比,饮酒指数不小于100的人群BPDE-DNA加合物含量明显升高,差别具有统计学意义(P＜0.05)。随吸烟指数的增加,加合物含量有所上升,但差别无统计学意义。
2.2BPDE-DNA加合物含量与ERCC1 C19007T、C8092A基因多态及单体型之间的关系
ERCC1 C8092ACA与AA基因型与CC野生型比较,人群外周血淋巴细胞中BPDE-DNA加合物含量升高,差别具有统计学意义(P＜0.05)而ERCC1 C19007TCT、TT基因型与CC野生型比较,BPDE-DNA加合物含量无明显变化。与C/C单体型比较,C/A单体型中ORa值为1.888(95%CI1.466-2.432),且其他人数分布频率小于5%的单体型也有较高的ORa值(ORa=2.00895%CI1456-2.769)。
2.3BPDE-DNA加合物含量的多因素分析
高水平BPDE-DNA加合物的风险与年龄、饮酒指数及ERCC1C8092AA等位基因相关联,差别有统计学意义(P＜0.05),其中,ERCC1 C8092AA等位基因突变对高水平BPDE-DNA加合物的影响程度最大,贡献度为42.8%。
3.改良彗星实验检测BaP所致淋巴细胞DNA损伤的相关分析
3.1彗星尾距(尾面积)比值与性别、年龄、饮酒、吸烟情况之间的关系50-69岁和≥70岁年龄组人群与对照组(＜30岁)比较,尾距比值与尾部面积比值均升高,差别具有统计学意义(P＜0.05)。性别、饮酒指数和吸烟指数对彗星尾距比值和尾部面积比值影响均无统计学意义。
3.2彗星尾距(尾面积)比值与ERCC1 C19007T、C8092A基因多态之间的关系
与ERCC1 C8092ACC野生型比较,CA与AA基因型彗星尾距比值与尾部面积比值明显升高,差别有统计学意义(P＜0.05)。ERCC1 C19007T基因多态对彗星尾距比值和尾部面积比值的影响均不具有统计学意义。
3.3彗星尾距(尾面积)比值的多因素分析
ERCC1 C8092AA等位基因突变与彗星实验尾距比值和尾部面积比值在所有因素中的影响程度最大,贡献度分别为37.4%和22.7%。
3.4BaP所致DNA损伤综合评分与ERCC1 C8092A多态的关联
ERCC1 C8092ACC、CA与AA基因型DNA损伤评分分别为46.19、72.76和104.7。随A等位基因的增加,DNA损伤程度明显加大,差别具有统计学意义(P＜0.01)。
4.BPDE处理后ERCC1及CAST mRNA表达水平与ERCC1基因多态的关联
C8092AAA基因型CAST mRNA表达水平明显低于C8092ACC野生型(P＜0.05)。而ERCC1 mRNA表达水平染毒后各基因型之间无明显差异。
结论：
1.ERCC1 C8092AA等位基因可增加高水平BPDE-DNA加合物的风险、与苯并(a)芘所致DNA损伤修复能力降低相关联。
2.ERCC1 C8092A多态可能通过影响个体DNA损伤修复效率,而成为一个意义确切的与环境致癌因子相关的肿瘤易感性生物标志。
3.位于ERCC13’末端非编码区和RNA聚合酶Ⅰ亚单位基因CAST的编码区的ERCC1 C8092A多态的AA基因型可降低CAST基因mRNA水平,提示其通过影响CAST基因表达或/和ERCC1转录后调控而发挥作用。