海豚链球菌(Streptococcus iniae,曾用名Streptococcus shiloi),隶属于乳杆菌目(Lactobacillales),链球菌科(Streptococcaceae),链球菌属(Streptococcus);是重要的水生动物病原菌之一。1976年海豚链球菌首次从淡水海豚上分离报道。此后的几十年,其感染的宿主范围不断扩大,主要危害罗非鱼,虹鳟,鲑鱼等温带水域有鳍鱼类。1995年以来加拿大、美国、香港、新加坡等地相继报道了人类感染海豚链球菌的临床病例,海豚链球菌的公共卫生意义逐渐被人们重视。斑点叉尾鮰(Channel Catfish Ictalurns Punctatus)是全球知名的淡水养殖品种,也是我国重要的淡水经济鱼类之一,在四川、湖北、安徽等30多个省市地区广泛养殖。斑点叉尾鮰一度被认为不感染链球菌,然而近几年斑点叉尾鮰链球菌病出现临床报道,并在当地引起暴发性流行。但在病原生物学特性、病理损伤、致病机理和诊断方法上缺乏系统研究,因此给生产上斑点叉尾鮰链球菌病的防治和诊断带来困难。本研究以广西网箱养殖自然发病斑点叉尾鮰为研究对象,围绕病原学、病理学和诊断方法开展了系统研究,旨在明确广西斑点叉尾鮰链球菌病的病原、菌株生物学特性和病理损伤机制,并为生产养殖上准确诊断和有效防治该病提供科学参考。1.斑点叉尾鮰链球菌病病原分离鉴定从广西网箱养殖发病斑点叉尾鮰肝、脾、肾和脑中分离到致病性球菌DGX07,经人工感染试验证实其为斑点叉尾鮰暴发性传染性疾病的病原菌。对菌株的形态特征和生化特性检测,结果显示其为革兰氏阳性链状球菌,具有β溶血活性,有荚膜,接触酶(-),吡咯烷酮-β-萘胺(PRYA)(+)等。菌株16SrRNA基因(FJ951434)与S.iniae-ATCC29178 (AF335572)同源性达99.7%,系统发育树中与海豚链球菌聚为一簇。结合菌株的形态特征、生化特性和16S rDNA序列分析,DGX07被鉴定为海豚链球菌。采用Kirby-Bauer琼脂扩散法对S.iniae-DGX07进行药敏检测,结果表明菌株对多数的氯霉素类、p-内酰胺类、大环内酯类、四环素类和喹诺酮类药物敏感,而对氨基糖苷类和磺胺类药物不敏感。2.斑点叉尾蛔源海豚链球菌生物学特性从培养特性、血清分型、致病性和毒力基因检测上,对菌株的生物学特性进行研究。结果显示菌株能在10℃-45℃, NaCl0%～4%和pH6.0～9.0的条件下存活；在TSA、THA、BHI等多种培养基上均能生长,其中以兔血TSA、THA和BHIa上生长良好。采用随机片段多态性DNA标记推断S.iniae-DGX07为血清Ⅰ型。菌株具有pgmA, cpsD, cpsK和sagA毒力基因,其葡萄糖磷酸变位酶pgmA (JF795256)与GenBank中公布的海豚链球菌同源性为99.9%,荚膜多糖基因cpsD(JF795257)为99.3%,荚膜多糖基因cpsK (JF795255)和溶血素基因sagA均为100%。菌株对斑点叉尾鮰和小白鼠的半数致死剂量分别为4.93×106CFU和3.51×105CFU。3.斑点叉尾鮰感染海豚链球菌病理形态学研究对自然发病和人工感染海豚链球菌的斑点叉尾鮰进行组织病理、细胞病理和血液生化等病理学研究。临床表现为嗜睡或水中异常游动,体色变深,鳍条边缘褪色,下颌和鳍条充血、出血,内脏肿胀、充血明显；伴有肠炎和腹水。组织学观察表现为全身多组织器官的急性炎症反应和局灶性坏死。脾脏、肾脏和肝脏是感染损伤的靶器官,出现变质性坏死；伴有心外膜炎、脑膜炎和卡他性肠炎。超微病理学上,病鱼主要脏器细胞超微结构破坏,特别是线粒体和细胞核的损伤明显。线粒体表现为肿胀,嵴断裂溶解消失；细胞核核膜扩张、染色质浓缩边移。电子显微镜下,各脏器吞噬细胞内可见分裂增殖的S.iniae-DGX07。血液学分析发现血红蛋白(Hb)、红细胞数(RBC)、总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、胆固醇(CHO)、肌酐(Cr)、钠(Na+)、氯(Cl-)、钙(Ca2+)降低,白细胞数(WBC)、谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、尿素(BUN)、血钾(K+)升高。4.斑点叉尾鮰感染海豚链球菌组织分布规律研究采用组织定量接种法和免疫组化法对人工感染斑点叉尾鮰不同时间点细菌组织分布情况进行观察,结果显示肝脏、脾脏和肾脏是细菌的主要分布脏器。定量接种法显示感染后5h脾脏、肾脏、肝脏和血液最先检出少量细菌,在感染后48h各脏器出现细菌峰值,到达120h时细菌量显著下降。免疫组化法检测显示细菌阳性信号主要分布在脾脏、肾脏和肝脏且集中在吞噬细胞内、血液中和细胞间质区域。5.斑点叉尾鮰源海豚链球菌ELISA检测方法建立采用兔抗S.iniae-DGX07多克隆抗体,通过棋盘滴定法进行条件筛选成功建立了检测斑点叉尾鮰源海豚链球菌的间接ELISA方法。结果显示该方法特异性好,与嗜水气单胞菌、鮰爱德华氏菌、维里纳气单胞菌、鲁氏耶尔森氏菌、豚鼠气单胞菌、无乳链球菌、嗜麦芽寡养单胞菌无交叉反应；板间和板内变异系数均低于10%；灵敏度达1.5×105CFU/mL,即每孔的检测限为104CFU。肝、肾、脾和脑判定的临界OD450值分别为0.467、0.454、0.630和0.594。对人工感染斑点叉尾鮰脾、肾、肝和脑分别检出时间为12h、24h、48h和48h,检出率分别为100%、75%、50%和40%。6.斑点叉尾鮰源海豚链球菌双重PCR检测方法建立根据已知的海豚链球菌16S rRNA基因和乳酸盐氧化酶lctO基因,选取16S rRNA上链球菌属细菌保守区域和lctO上海豚链球菌保守区域,分别设计一对引物,构建了从种属上特异性检测海豚链球菌的双重PCR方法。PCR反应最适条件dNTP (10mM) 1.0μL, MgCl2 (25mM) 1.5μL, 10pM 16S rRNA F/R:1 OpM lctO F/R (1:5)的混合引物2μL, Taq酶(5U/μL) 0.4μL,10×PCR Buffer 2.5μL,模板DNA1μL, ddH2O补至25μL。构建的双重PCR最低检测限量为650pg。人工感染的斑点叉尾鮰肝脏、脾脏和肾脏24h样本中病原检出率为100%。