红树植物桐花树单宁结构与抗氧化活性及其养分保存策略

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红树林是分布于热带亚热带海岸带特有的木本植物群落,是我国珍稀的海岸自然资源。红树林生长在高盐、缺氧、低养分有效性的恶劣潮间带生境,高的单宁水平是一种进化优势。本文以在中国分布最为广泛的灌木型红树植物桐花树为研究对象,利用多种分离、分级技术和方法得到各种结构不同的桐花树单宁聚合物;以基质辅助激光解吸附离子化飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)为主,联合核磁共振(NMR)、液相色谱-质谱(LC-MS)及高效液相色谱(HPLC)等技术对分离得到的桐花树单宁进行结构测定;采用DPPH自由基法、ABTS自由基法和铁离子还原抗氧化法(FRAP)三种体外抗氧化测试模型对分离得到的桐花树单宁及其体内的多酚类物质进行自由基清除能力和抗氧化活性测定;同时研究了桐花树叶片单宁含量、抗氧化活性及养分对盐度和光照的响应;并系统探讨桐花树叶片单宁含量、氮磷含量、氮磷比和氮磷内吸收率的季节动态,以揭示桐花树的营养限制状况和对恶劣生境的适应机制。开展此项研究不仅对揭示桐花树单宁的结构与功能具有重要的理论价值,也为后续开发利用桐花树单宁提供了科学依据,还对理解营养限制下桐花树的养分保存策略具有重要的意义。   1.系统研究了桐花树繁殖体和叶片在发育过程中单宁及抗氧化活性的动态变化,发现不同发育阶段繁殖体和叶片提取物均具有较强的自由基清除能力和抗氧化活性,且与其总酚含量呈显著正相关。构成繁殖体和叶片缩合单宁的主要结构单元是(表)桔儿茶素和(表)桔儿茶素桔酸酯。在繁殖体发育过程中可溶性缩合单宁的平均聚合度(mDP)逐渐升高,而在叶片发育及衰老过程中可溶性缩合单宁的mDP则呈先升高后降低的趋势。另外,不同发育阶段繁殖体和叶片结合态缩合单宁的mDP均显著高于其可溶性缩合单宁的mDP。   2.利用甲醇、乙酸乙酯和蒸馏水三种不同极性溶剂分别对桐花树叶片、树皮和根皮提取时,发现甲醇的提取效果最好,其提取物中的总酚含量(TP)和可溶性缩合单宁含量(ECT)最高。不同部位缩合单宁主要是由表桔儿茶素和表桔儿茶素桔酸酯构成的原翠雀素类型,同时伴有少量由表儿茶素和表儿茶素桔酸酯构成的原花青素类型。叶片、树皮和根皮缩合单宁的mDP分别为13.5、7.4和12.3。另外,不同部位单宁均具有较强的抗氧化活性,特别是树皮和根皮单宁的抗氧化能力均优于天然抗氧化剂抗坏血酸和人工合成抗氧化剂BHA。   3.聚合度是影响单宁生物活性的重要结构特征之一。采用Sephadex LH-20凝胶色谱柱法,选用不同体积比例的甲醇、丙酮和水作为洗脱剂,按照聚合度对桐花树树皮缩合单宁聚合物进行分级分段洗脱,得到了mDP介于2.0~12.8之间的不同级分树皮缩合单宁。同时结合各级分段的相对TP和总黄酮含量(TF)以及它们各自的抗氧化活性进行相关分析,发现各级分段的抗氧化能力与其TP含量和TF含量呈显著正相关,而与其mDP呈显著负相关。   4.利用温室控制实验探讨了不同盐度(0‰、5‰、15‰、25‰和35‰)对桐花树幼苗单宁形成及自由基清除能力和抗氧化活性的影响,发现桐花树生长的最适盐度介于5‰~15‰之间,低于或高于这个盐度范围,桐花树幼苗的生长均会受到抑制。随着培养液中盐度的增加,幼苗叶片TP、TF和ECT含量呈先降低后升高的趋势,这与生长分化平衡假说的预测一致。另外,不同盐度处理的桐花树幼苗叶片的自由基清除能力和抗氧化活性与其TP、TF和ECT含量均呈显著正相关。表明盐度能够促进桐花树幼苗体内单宁的形成,从而降低盐分对幼苗体内活性氧水平的影响,进而缓解盐分对自身造成的伤害。   5.研究了光照对桐花树叶片单宁及氮磷含量的影响,发现不同季节阳叶TP、ECT和总缩合单宁含量(TCT)均显著高于阴叶。阳叶氮(N)含量在秋季高于阴叶,夏季却低于阴叶,冬季和春季之间没有显著差异;对于磷(P)含量,不同季节阳叶P含量间存在显著差异,冬季最高,夏季最低。另外,除秋季外,其它季节阳叶的TP∶N和ECT∶N比值均显著高于阴叶。表明光照强度促进了桐花树体内单宁的形成,阳叶高的单宁水平可以减轻自身的氧化胁迫,且较高的TP∶N和ECT∶N比有利于提高自身抵御病虫害的能力。   6.探讨了桐花树叶片单宁、氮磷含量的季节动态及其生境的营养限制状况。成熟叶N、P含量的季节变化趋势相似,冬季最高,夏季最低,且均显著高于衰老叶。成熟叶N∶P比的季节变化范围为9.23±0.92~11.55±0.55,均小于14,存在N限制。四季叶片氮内吸收率均显著高于磷内吸收率,且N为完全内吸收。成熟叶和衰老叶均具有较高的TP和ECT含量;随着叶片的衰老,TP∶N和TCT∶N的比值均显著升高。叶片中较高的单宁水平、养分内吸收率及衰老叶中高的TP∶N和TCT∶N比是生长在贫瘠立地条件下红树植物桐花树的重要养分保存策略。
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