微囊藻是最常见的水华蓝藻之一,因其中的部分种类能够产生具有急性毒性与促肿瘤作用的微囊藻毒素（microcystin,MC）而受到公众及相关研究人员的关注。武汉市湖泊众多,富营养化明显,近年来有关该地区湖泊水华的发生过程、生态危害、产毒藻株、毒素毒性机制、健康危害等研究的报道不多、资料较少。光照是驱动光合生物微囊藻生长代谢的重要力量之一,不同光照性质、强度、时间对微囊藻的生长、代谢及生物量积累有不同影响。在光照总量相同的前提下,长时间的低光照和短时间的高光照是否会对微囊藻株具有相同的影响效果,目前尚无资料可循。从光照时间的角度考虑,一年四季湖泊接受的光照时间存在明显差异,是否光照时间越长,微囊藻生长越好,MC越多,尚有待解答。MC的种类较多,其中微囊藻毒素-RR（microcystin-RR,MC-RR）的毒性相关资料相对较少,目前大多数MC的毒理学研究都以动物不同脏器作毒性及机制为研究目标,而有关MC对动物水代谢影响的研究稀缺,MC对不同实验动物的水代谢影响是否具有差异,有待探索。针对以上问题,本研究根据前期调查结果,首先选择有代表性富营养化湖泊,在水华季节采集水样、鉴定优势藻种、分离培养产毒藻株,分析毒素性质、种类,比较不同湖泊之间产毒藻种及毒素异同,初步勾勒出武汉受调查湖泊产毒藻种及毒素的特征。在此基础上,本研究在评估了昼夜节律变化过程中微囊藻生物钟影响效果的前提下,探索不同光照强度和光照时间组合作用对分离的产毒微囊藻株生长特性及毒素产量的影响,系统的研究光照时间对MC水平的影响,衡量光照时间在光照因素中的贡献。同时,使用自然水华中分离纯化的MC-RR,研究比较MC-RR对Sprague-Dawley（SD）大鼠和Kunming（KM）小鼠水代谢影响的异同。第一部分微囊藻产毒藻株的分离培养及生长产毒性质研究目的:从不同水华环境优势藻种中分离筛选出具有产毒能力的微囊藻株,比较不同藻株的产毒性质,考察培养藻株的生长曲线与连续长期传代后形态及产毒能力的变化,为揭示受调查湖泊MC污染特点提供科学依据,同时为后续深入研究相关微囊藻的生理生长特性提供合适的实验对象。方法:从武汉市5个湖泊中采集水华样本,采用显微镜下毛细吸管挑取与固体培养基分离相结合的方法分离微囊藻株,并对水华中的MC进行检测;结合藻株的藻蓝蛋白基因间隔序列分析及显微镜下形态特征,对分离藻株的种属进行鉴定;通过PCR方法对藻株微囊藻毒素合成酶基因mcy A、mcy B和mcy D的联合检测,筛选出具有产毒能力的微囊藻株,并采用高效液相色谱对藻株的产毒性质进行鉴定;通过对产毒微囊藻藻株生长周期与毒素的监测,观察其生长特点及产毒能力变化。结果:受调查湖泊的水华中检测到MC-RR与微囊藻毒素-LR（microcystin-LR,MC-LR）混合毒素,多数情况下以MC-RR的含量比例较高。从蓝藻水华中共分离得到15株微囊藻,其中鱼害微囊藻5株,挪氏微囊藻2株,铜绿微囊藻2株,水华微囊藻及惠氏微囊藻各1株,不确定藻种的微囊藻4株;在15株分离藻株中有7株能够产生微囊藻毒素:在MC标准品MC-RR、MC-LR和微囊藻毒素-YR（microcystin-YR,MC-YR）的参照下,藻株DL2、DL3、ZP2和ZP3只检测到MC-LR;藻株LH1的毒素组成为MC-RR和MC-LR;藻株ZP7以MC-RR为主,检测到少量MC-YR;藻株DL1中检测到MC-RR、MC-YR和MC-LR三种毒素,其中MC-RR含量最高;微囊藻株生长周期超过60天,细胞计数结果与吸光度值在生长前期具有较好的一致性,但当藻细胞进入平台期后,吸光度值的变化相对滞后;实验室内传代培养一年后,分离藻株的形态由群体逐渐向小群体及单细胞形态转变,产毒藻株的产毒性状未见明显改变。结论:受调查武汉市的水华湖泊混合MC中,MC-RR占有优势;从湖泊中筛选到7株具有产MC能力的微囊藻株,藻株的主要产毒种类与湖泊中一致,且产毒性状稳定。分离藻株实验室内培养周期长,藻液吸光度值可在对数生长期内反映藻细胞生长情况。藻株DL2产生毒素类型单一、产量高、易于培养,适用于进一步研究微囊藻株生理特性,并有助于MC的获取与纯化。第二部分昼夜节律变化过程中微囊藻生物钟调控的初探目的:在昼夜节律改变的条件下,评估生物钟作用对微囊藻的生长及毒素合成的影响。方法:将经过12 h:12 h昼夜节律驯化的微囊藻株FACHB-905分别置于持续光照、持续黑暗以及不同节律（19.5 h:4.5 h）的光-暗周期下,以原有12 h:12 h的昼夜交替环境为对照组,通过观察微囊藻细胞浓度、450 nm和680 nm吸光度值以及光合作用相关基因psa B、psb D1、rbc L和微囊藻毒素合成酶基因mcy B、mcy E的转录水平24 h动态变化,探究微囊藻株的生长与MC合成是否受生物钟调节的影响。结果:在12 h:12 h节律的对照组中,藻液吸光度值及psa B、psb D1、rbc L、mcy B和mcy E基因的转录水平皆呈现为规律性的昼升夜降现象;在改变原有光暗节律的光照干扰组中,藻液的吸光度值与psa B、psb D1、rbc L、mcy B和mcy E基因的转录水平随着光照的出现而升高;持续光照组的光合作用相关基因（psa B、psb D1和rbc L）转录水平均升高;持续黑暗组的光合作用相关基因（psa B、psb D1和rbc L）转录水平皆降低;mcy B和mcy E基因的转录水平在持续光照和持续黑暗组中的动态变化无明显规律。结论:微囊藻株FACHB-905的生长及psa B、psb D1、rbc L、mcy B和mcy E基因表达水平具有昼夜节律现象,该现象依赖于光照调控,当昼夜节律改变时,其生物钟调节现象不明显。第三部分不同组合形式光照对微囊藻产毒株生长及细胞内微囊藻毒素水平影响的研究目的:通过对微囊藻细胞的生长及其中MC水平等指标的检测,探索在相同光照总量条件下,不同光照强度和光-暗周期组合对微囊藻株的生长和细胞内MC水平的影响。方法:选择具有MC产毒能力的微囊藻株DL2作为研究对象。设置光照总量相同的两个实验组:光照强度12.5μmol m-2 s-1,光-暗周期为16 h光照8 h黑暗（16 L:8 D）的实验组;光照强度25.0μmol m-2 s-1,光-暗周期为8 h光照16 h黑暗（8 L:16 D）的实验组。比较两实验组藻细胞的生长,并采用液相色谱质谱联用技术分析藻细胞的微囊藻毒素水平。拆分两种光照因素,分别探索光照强度与光-暗周期对微囊藻生长与微囊藻毒素水平的影响:（1）在稳定的12 h:12 h光-暗周期下,设置光照强度分别为12.5μmol m-2 s-1、25.0μmol m-2 s-1和31.2μmol m-2 s-1三个实验组,比较各组藻细胞的生长与MC含量。（2）在固定光照强度为25μmol m-2 s-1条件下,设置光-暗周期分别为:8L:16 D、10 L:14 D、12 L:16 D、14 L:10 D和16 L:8 D五个实验组,比较光照时间对各组藻细胞生长的影响;同时选取两个不同生长阶段（最快生长期与对数生长晚期）的微囊藻细胞,检测并比较五种不同的光-暗周期对细胞内的MC水平及mcy B和mcy E基因相对转录水平的影响。在光照强度25μmol m-2 s-1条件下,设置9 L:15 D、12 L:12D和15 L:9 D三个光-暗周期实验组,采用Real-time PCR方法对藻株mcy B和mcy E基因的相对转录水平进行24小时监测,探究不同光-暗周期对藻株MC影响的机制。结果:相同光照总量在不同的光照强度和光-暗周期组合的作用下,对微囊藻株DL2的生长及MC水平的影响不一致:经3天的培养,12.5μmol m-2 s-1+16 L:8 D实验组的藻细胞浓度比25.0μmol m-2 s-1+8 L:16 D实验组更高;12.5μmol m-2 s-1+16 L:8 D实验组的藻细胞内MC-LR含量低于25.0μmol m-2 s-1+8 L:16 D实验组。光照单因素拆分研究实验结果显示:（1）培养液中微囊藻细胞的浓度随着光照强度的增加而升高,31.2μmol m-2 s-1实验组微囊藻MC-LR水平在第二天及第三天均明显高于12.5μmol m-2 s-1实验组（p=0.007;p=0.002）,25.0μmol m-2 s-1实验组藻细胞中MC-LR在第三天明显高于12.5μmol m-2 s-1实验组（p=0.023）,但25.0μmol m-2 s-1和31.2μmol m-2 s-1两组的藻细胞MC-LR含量未见统计学差异。（2）随着光照时间的延长,对应实验组中微囊藻细胞的浓度依次增加;在五组不同光-暗周期作用下,最快生长期和对数生长晚期的微囊藻细胞内MC-LR含量以及mcy B、mcy E基因的相对转录水平皆未见统计学差异;9 L:15 D、12 L:12 D和15 L:9 D三组光-暗周期的微囊藻毒素合成酶基因相对转录水平的24 h监测结果显示:白昼开始后四小时,三个实验组的mcy B和mcy E基因皆出现了相对转录水平的显著升高,但该升高状态并未随着光照时间的延长而持续,三个实验组的微囊藻毒素合成酶基因转录水平皆在白昼开启后的第三个监测时点回落。结论:不同光照强度与光-暗周期组合的相同光照总量对微囊藻产毒株的生长及MC含量的影响是非等效的;微囊藻细胞的生长同时受光照强度及光照时间的影响,光照强度的增加和光照时间的延长皆能促进微囊藻细胞的生长,但生物量的增长与物理量的增加不完全同步;光照强度影响微囊藻的MC水平,而不同光-暗周期对微囊藻细胞内MC含量无明显影响;不同光-暗周期对mcy B和mcy E基因的转录水平及动态变化无明显影响,昼夜交替过程中,mcy B和mcy E基因的转录水平在白昼（光照）开启后皆呈现出一过性升高。第四部分微囊藻毒素-RR对SD大鼠和KM小鼠水代谢影响的比较研究目的:研究MC-RR对SD大鼠和KM小鼠水代谢的影响,并比较MC-RR引起两种实验动物水代谢的差异。方法:用MC-RR对SD大鼠及KM小鼠进行单剂量染毒实验,观察并比较两种实验动物的饮水、尿量、体重变化,并分析与水代谢相关的肾脏和肝脏生化指标与组织病理学的改变。SD大鼠的染毒剂量为:574.7μg/kg、287.3μg/kg、143.7μg/kg和0.0μg/kg,KM小鼠的染毒剂量为:210.0μg/kg、105.0μg/kg、52.5μg/kg和0.0μg/kg。根据单剂量染毒实验结果,采用不同剂量的地塞米松对高剂量组（574.7μg/kg）SD大鼠进行干预实验,通过监测相应阳性指标的变化验证SD大鼠水代谢异常的原因;对KM小鼠进行连续28天的MC-RR染毒实验,分组染毒剂量为140.0μg/kg、70.0μg/kg、35.5μg/kg和0.0μg/kg,并在染毒停止后继续观察14天,监测KM小鼠的饮水、尿量、体重变化及相关的肝肾指标的变化,比较MC-RR对两种实验动物水代谢影响的异同。结果:在单剂量染毒实验中,大鼠高剂量组（574.7μg/kg）出现了明显的多饮、多尿、蛋白尿、血尿及体重增长减缓症状,这些症状能被地塞米松缓解。随着MC-RR染毒剂量的升高,大鼠的肾脏和肝脏出现了梯度损伤,但小鼠各剂量组皆未出现水代谢异常及肾脏损伤。在连续28天的MC-RR染毒实验中,小鼠高剂量组（140.0μg/kg）出现了明显的多饮、多尿、体重增加减缓及肝脏损伤,但与肾脏损伤相关的尿液及血清学指标未见明显异常,未观察到小鼠肾脏的组织学损伤。在MC-RR染毒停止后,小鼠的水代谢异常及肝脏损伤逐步恢复。结论:MC-RR通过损伤肾脏的途径引起SD大鼠的水代谢异常;SD大鼠的肾脏比KM小鼠的肾脏对MC-RR更敏感;MC-RR在持续染毒条件下可引起KM小鼠的水代谢异常,但未观察肾脏的器质性损伤。