目的:本研究在络病理论指导下,依据中医“久卧伤气”之说,建立络气虚滞型血管内皮功能障碍病证复合模型,探讨“络气虚滞”状态下血管内皮功能改变、全身性NEI网络调控变化规律及二者的内在联系;初步阐明模型大鼠内皮功能障碍发生的局部免疫损伤机制;利用体外细胞培养从基因与蛋白水平揭示NEI网络关键化学信号分子异常改变与血管内皮功能障碍密切相关的分子机制,从而阐明过逸所致络气虚滞型血管内皮功能障碍病生理学机制,并探索不同类别通络药物的作用机制,为络病理论指导血管病变防治提供科学依据。方法:本研究分为以下四部分内容:1.络气虚滞(过逸伤气)型血管内皮功能障碍大鼠模型的建立及通络方药的干预作用本研究在HHcy致血管内皮功能障碍这一病理模型的基础上,依据“久卧伤气”中医理论,施加“高营养饮食+限制活动”因素建立络气虚滞型血管内皮功能障碍病证复合大鼠模型。120只雄性Wistar大鼠随机分为以下8组:(1)正常对照组;(2)血管内皮功能障碍模型组(HCY组);(3)络气虚滞证候模型组(证候模型组);(4)络气虚滞型血管内皮功能障碍模型组(复合模型组);(5)复合模型+人参组(人参组);(6)复合模型+四味通络组(四味通络组);(7)复合模型+通心络组(通心络组);(8)复合模型+辛伐他汀组(辛伐他汀组)。每组15只。正常对照组与HCY组大鼠置于代谢笼中(单笼),前者饲以普通饲料,后者喂饲含3%高蛋氨酸饲料,自由饮水;证候模型组、复合模型组与用药组大鼠分别置于经改造过的代谢笼中(单笼),笼内空间以其保持基本安静且能够转身移动为标准,均饲以高营养饲料,其中证候模型组大鼠饲料中不含3%高蛋氨酸,其他各组均含,所有大鼠均自由饮水。实验开始按1ml/100g体重给予各用药组动物相应药物口服灌胃,正常对照组与各模型组大鼠给予等量的0.5% CMC-Na灌胃。共计10周。参照已建立的络气虚滞辨证诊断标准,通过对大鼠生物学表征半定量评分、力竭游泳时间、呼吸与心率、主动脉内膜(内皮细胞)病理组织形态学光镜、电镜观察及反映血管内皮功能相关生化指标的检测,对模型做出综合客观评价,并观察三种不同类型通络方药的干预作用。2.络气虚滞(过逸伤气)型血管内皮功能障碍模型大鼠NEI网络变化及通络方药干预作用研究应用络气虚滞型血管内皮功能障碍病证复合大鼠模型,以NEI网络中共同化学信号分子为切入点,通过检测大鼠下丘脑-垂体-肾上腺轴:下丘脑促肾上腺皮质激素释放激素(ELISA法)、血浆促肾上腺皮质激素(放免法)、血清皮质酮(放免法);下丘脑-垂体-甲状腺轴:下丘脑促甲状腺素释放激素(ELISA法)、血清促甲状腺激素(放免法)、三碘甲状腺原氨酸及甲状腺素(放免法);外周血免疫细胞因子:白细胞介素-1β、干扰素-γ、肿瘤坏死因子-α(放免法)等指标,观察“络气虚滞”证候状态下“气络-NEI网络”调控变化规律及通络方药的干预作用、运用典型相关分析方法揭示NEI网络调控失衡与血管内皮功能障碍之间的内在联系。3.络气虚滞(过逸伤气)病证复合模型大鼠血管内皮细胞损伤免疫学机制及通络方药的干预作用研究通过对模型大鼠外周血抗血管内皮细胞抗体(ELISA法)、主要组织相容性复合体(MHC)-Ⅱ类分子以及细胞粘附分子ICAM-1、VCAM-1的表达(免疫组织化学法及半定量分析)的检测,对局部血管内皮细胞的免疫损伤机制进行深入研究,从另一角度阐明模型大鼠的病生理学机制并观察通络方药的干预作用。4. p38 MAPK信号转导通路在TNF-α诱导HUVEC分泌ET-1与eNOS中的作用及通络方药的影响本研究在离体条件下观察TNF-α诱导HUVEC细胞表达ET-1与eNOS以及p38 MAPK信号转导通路在其中的作用,通过检测不同浓度TNF-α(0、2.5、5、10、15、20ng/ml)在不同时间(0、1、2、4、8、12、24h)干预后HUVEC培养上清液中ET-1、eNOS含量;Western blot与Real time RT-PCR检测血管内皮细胞ET-1、eNOS蛋白及mRNA表达:(1)正常对照组;(2)TNF-α组:细胞中加入终浓度为10ng/ml的TNF-α;(3)SB203580组:SB203580(终浓度为25μmol/L)预孵育细胞1h,然后加入终浓度为10ng/ml的TNF-α;(4)-(6)通心络干预组:通心络超微粉(终浓度依次为100μg/ml、500μg/ml、1000μg/ml)预孵育细胞1h,然后加入终浓度为10ng/ml的TNF-α;(7)-(9)辛伐他汀干预组:辛伐他汀(终浓度依次为0.1μmol/L、1μmol/L、10μmol/L)预孵育细胞1h,然后加入终浓度为10ng/ml的TNF-α,每组3个复孔。各组细胞培养12h后终止实验,进行蛋白及总RNA的提取及检测;分别于实验10min、30min、60min后采用Western blot测定各组细胞中p-p38 MAPK表达:(1)正常对照组:(2)TNF-α组:细胞中加入终浓度为10ng/ml的TNF-α;(3)SB203580组:SB203580(终浓度为25μmol/L)预孵育细胞1h,然后加入终浓度为10ng/ml的TNF-α;(4)通心络干预组:通心络超微粉(终浓度为500μg/ml)预孵育细胞1h,然后加入终浓度为10ng/ml的TNF-α;(5)辛伐他汀干预组:辛伐他汀(终浓度为10μmol/L)预孵育细胞1h,然后加入终浓度为10ng/ml的TNF-α,每组3个复孔。在基因及蛋白水平进一步阐明NEI网络关键化学信号分子与血管内皮功能障碍密切相关的分子机制及通络方药的干预作用。结果:1.络气虚滞(过逸伤气)型血管内皮功能障碍大鼠模型的建立及通络方药的干预作用模型建立后,从以下几方面对模型进行评价:(1)生物学表征观察及评分:复合模型组大鼠随造模时间的延长表现倦怠懒动,精神萎顿,四肢蜷缩,行动迟缓,甚则眯眼、缩肩拱背;皮肤松驰,背部毛色无光泽;尾、鼻颜色淡白少润;大便稀软但有形,生物学表征评分均显著升高(P<0.01);(2)力竭游泳时间:与正常对照组比较,证候模型组与复合模型组大鼠游泳时间均明显缩短(P<0.05);(3)生理功能检测:与正常对照组比较,证候模型与复合模型组大鼠呼吸频率、心率明显加快(P<0.05或P<0.01);(4)胸主动脉形态光镜及超微结构电镜观察:光镜结果显示,复合模型组大鼠胸主动脉内皮细胞肿胀、分布不均匀、密度增加或减少,内膜增厚并可见炎细胞附壁、内膜内有大量炎细胞浸润;平滑肌细胞密度增加、排列紊乱。电镜结果显示,内皮细胞线粒体绝大部分嵴和大部分膜融合或消失,粗面内质网腔扩张,呈圆形或椭圆形,有明显脱颗粒现象,吞饮小泡数量显著减少。(5)血管内皮功能相关指标检测:与正常对照组比较,HCY组与复合模型组大鼠血浆ET、血清vWF、sICAM-1含量明显升高(P<0.01或P<0.05),血清NO含量均显著降低(P<0.01)。该复合模型既有络气虚滞证的“证候”表现,又具有内皮功能障碍“病”的特征,反映了“辨病”与“辨证”的有机结合,因而模型的制备是成功的,为进一步探讨其病生理学机制提供了实验平台。证候模型大鼠的主动脉内膜(内皮细胞)形态结构也受到不同程度地损伤、血清NO含量降低、vWF与sICAM-1水平显著增高,表明单纯络气虚滞(过逸伤气)证亦可造成血管内皮功能障碍的发生;当证候因素与HHcy复合后,复合模型组大鼠血浆ET、血清NO、vWF较之病理模型组虽无显著改变,但血清sICAM-1含量升高明显(P<0.05),提示其与HHcy存在非线性叠加效应,可使内皮细胞损伤程度更为严重。三种类别通络方药均可明显改善复合模型大鼠的生物学表征,延长大鼠力竭游泳时间,降低大鼠的心率及呼吸频率,在缓解模型大鼠络气虚滞证候表现上显示出优势,且三组间比较无差异(P>0.05),而辛伐他汀则无此作用。在血管内皮功能改善与病理损伤修复方面,三类通络方药与辛伐他汀均可不同程度地减轻模型大鼠胸主动脉内膜(内皮细胞)病理形态学损伤;降低模型大鼠血浆ET、血清vWF、sICAM-1含量(P<0.01或P<0.05),从而保护血管内皮功能,而通心络组大鼠血清NO含量明显升高,人参组与四味通络组则无显著改变,显示出通络复方在改善内皮功能上具有更广泛的调节作用,且与西药辛伐他汀无差异。2.络气虚滞(过逸伤气)型血管内皮功能障碍模型大鼠NEI网络变化及通络方药干预作用下丘脑-垂体-肾上腺轴:与正常对照组比较,HCY组大鼠血清CORT含量显著升高(P<0.01);证候模型组大鼠下丘脑CRH含量显著减少(P<0.01);血浆ACTH含量明显升高(P<0.01),血清CORT亦有增高趋势,但统计学无显著性差异(P>0.05);复合模型组大鼠下丘脑CRH含量显著减少(P<0.05),血浆ACTH、血清CORT含量均明显升高(P<0.01)。与HCY组比较,复合模型组大鼠血浆ACTH与血清CORT含量升高明显(P<0.05)。下丘脑-垂体-甲状腺轴:与正常对照组比较,HCY组与证候模型组大鼠下丘脑TRH及血清TSH含量均无显著改变(P>0.05),而血清T3、T4含量均显著减少(P<0.05或P<0.01);复合模型组大鼠下丘脑TRH、血清TSH、T3、T4含量均显著减少(P<0.05或P<0.01);与HCY组比较,复合模型组大鼠下丘脑TRH、血清TSH、T4水平亦显著降低(P<0.05或P<0.01)。外周血免疫细胞因子:与正常对照组比较,HCY组大鼠血清中IFN-γ含量显著升高(P<0.05),IL-1β与TNF-α含量无显著改变(P>0.05);证候模型组大鼠血清IL-1β与TNF-α含量均明显升高(P<0.05或P<0.01),IFN-γ含量无显著性改变(P>0.05);复合模型组大鼠血清IL-1β、IFN-γ、TNF-α含量均明显升高(P<0.05或P<0.01),且与HCY组比较升高程度亦具有显著差异(P<0.05或P<0.01)。上述结果表明,HHcy与络气虚滞证候均可以影响模型大鼠的HPAA、HPTA,导致模型大鼠外周血免疫(炎症)相关因子的过度异常表达,同时二者存在非线性叠加效应。复合模型大鼠HPAA功能处于亢进状态、HPTA功能处于抑制状态,免疫相关因子异常增高最为明显。通络药物干预影响:与复合模型组比较,人参组大鼠血浆ACTH含量减少(P<0.05);四味通络组、通心络组大鼠下丘脑CRH含量均明显升高(P<0.01或P<0.05)、血清CORT水平降低(P<0.01);通心络组大鼠血浆ACTH含量显著减少(P<0.05);辛伐他汀组大鼠各指标无显著性改变(P>0.05)。与复合模型组比较,人参组大鼠血清T3、T4含量明显升高(P<0.05);四味通络组大鼠除血清T3含量无显著变化外,其他指标均明显升高(P<0.05或P<0.01);通心络组大鼠上述指标含量均显著升高(P<0.05或P<0.01);辛伐他汀组大鼠仅血清T4含量升高(P<0.01)。与复合模型组比较,人参组大鼠血清IFN-γ、TNF-α含量明显减少(P<0.05或P<0.01);四味通络组大鼠血清TNF-α含量减少(P<0.05)、通心络组大鼠血清上述各细胞因子水平均明显降低(P<0.05或P<0.01)、辛伐他汀组大鼠血清IL-1β、TNF-α含量减少(P<0.05)。结果提示不同类别通络方药均可不同程度地调整复合模型大鼠NEI网络功能紊乱状态,其中以通心络的作用最为广泛且显著,而西药辛伐他汀作用不明显。内皮功能障碍生化指标与NEI网络共同化学信号分子典型相关分析结果显示第一典型相关系数有统计学意义(P<0.01),表明NEI网络功能紊乱与血管内皮功能障碍具有密切相关性。3.络气虚滞(过逸伤气)病证复合模型大鼠血管内皮细胞损伤免疫学机制及通络方药的干预作用与正常对照组比较,证候模型组大鼠血清AECA含量有增高趋势,但统计学无显著性差异(P>0.05);HCY组与复合模型组大鼠血清AECA含量均显著升高(P<0.05或P<0.01),两组间比较统计学无显著性差异(P>0.05)。与正常对照组比较,HCY组、证候模型组与复合模型组大鼠血管内皮细胞MHC-Ⅱ类分子、ICAM-1、VCAM-1阳性染色灰度值均明显降低(P<0.05或P<0.01)。由上可见,血清AECA含量增高、动脉组织中MHC-Ⅱ类分子及ICAM-1、VCAM-1表达增强共同参与了复合模型大鼠血管内皮功能障碍的发生,上述分子的异常表达可能是造成VED的免疫学基础之一,同时它们也是络气虚滞(过逸伤气)型血管内皮功能障碍发生的另一局部病生理学机制。各通络方药均可显著降低模型大鼠血清AECA含量、升高MHC-Ⅱ类分子、ICAM-1、VCAM-1阳性内皮细胞灰度值,抑制MHC-Ⅱ类分子及粘附分子在动脉内皮细胞的过度表达,且与阳性药辛伐他汀无差异。4. p38 MAPK信号转导通路在TNF-α诱导HUVEC分泌ET-1与eNOS中的作用及通络方药的影响从2h开始随时间延长各浓度的TNF-α均不同程度诱导HUVEC培养上清中ET-1表达增高(P<0.05或P<0.01),并于12h时间点达到峰值。与正常对照组(0 ng/ml)比较,在4h、8h、12h不同浓度TNF-α均可显著引起上清ET-1含量升高(P<0.05或P<0.01),以10 ng/ml浓度最为明显,但各浓度间比较无显著性差异(P>0.05)。从4h开始随时间延长各浓度的TNF-α均不同程度诱导HUVEC培养上清中eNOS表达降低(P<0.05或P<0.01);与正常对照组(0 ng/ml)比较,5～20ng/ml浓度TNF-α在4h、8h、12h时间点均可显著降低上清eNOS含量(P<0.05或P<0.01),但各浓度间比较无显著性差异(P>0.05)。与正常对照组比较,TNF-α干预组细胞中ET-1蛋白及mRNA表达明显增加(P<0.05或P<0.01),而eNOS蛋白表达及mRNA则明显降低(P<0.01);与TNF-α干预组比较,p38 MAPK特异性阻断剂SB203580及各用药组均可明显降低细胞ET-1蛋白及mRNA表达(P<0.05);与TNF-α干预组比较,各用药组细胞eNOS蛋白及mRNA表达均显著升高(P<0.01)。与正常对照组比较,TNF-α在各时间点均可显著升高细胞p-p38 MAPK蛋白表达(P<0.01)。与TNF-α组比较,SB203580分别于10min、30min时显著抑制p-p38 MAPK表达(P<0.05或P<0.01),且于30min时达到峰值,60min时抑制作用不显著;通心络与辛伐他汀在各时间点均可显著抑制TNF-α引起的p-p38 MAPK表达(P<0.01),以60min时效果最为明显(P<0.05)。这一结果充分表明p38 MAPK信号转导通路在TNF-α导致血管内皮细胞功能损伤过程中发挥关键作用。同时,通心络在不同时间(以60min时最显著)均可抑制TNF-α诱导的p38 MAPK磷酸化和活化,提示其降低HUVEC中ET-1、增高eNOS,从而显著改善内皮功能的作用机制与p38 MAPK信号转导通路有关。结论:1.首次建立过逸络气虚滞动物模型《素问·宣明五气篇》云:“久卧伤气”;张介宾亦云:“久卧则阳气不伸,故伤气;久坐则血脉滞于四体,故伤肉”,人体需要适当的活动,气血才能流畅,阳气才能得以振奋。本研究区别于既往采用疲劳法建立气虚证动物模型的思路,依据中医“久卧伤气”病机理论,同时紧密结合临床部分人群生活习惯过于安逸,易多发心脑血管疾病的现状,首次构建过逸络气虚滞动物模型,对于深入探讨上述人群血管病变发生发展的病生理学机制和临床治疗具有现实意义与借鉴价值。2.络气虚滞(过逸伤气)型血管内皮功能障碍病证复合模型的建立为深入研究其病生理机制提供了实验平台本研究以HHcy致血管内皮功能障碍为基础病理模型,施加“高营养饮食+限制活动”证候因素制备络气虚滞型血管内皮功能障碍病证复合模型,结果显示模型大鼠生物学表征显著改变,力竭游泳时间明显缩短,心率及呼吸频率增高,其表现基本体现“脉络-血管系统病”辨证诊断标准中络气虚滞证候特征;主动脉内膜(内皮细胞)形态病理学观察及血液生化指标检测证实模型大鼠出现血管内皮功能障碍,综合分析表明模型建立成功,为深入研究其病生理机制提供了实验平台。3.络气虚滞证候状态下全身性NEI网络调控失衡与局部血管内皮免疫损伤共同成为内皮功能障碍发生发展的重要病生理机制本研究发现,复合模型大鼠体内与NEI网络密切相关的关键化学信号分子存在异常改变,具体表现在下丘脑-垂体-肾上腺轴功能亢进、下丘脑-垂体-甲状腺轴功能抑制、IL-1β、TNF-α和IFN-γ等免疫细胞因子异常增高。典型相关分析证实其与血管内皮功能障碍之间密切相关,主要体现在NO、ET和TNF-α、IL-1β、HPAA之间相互影响,提示全身性NEI网络调控失衡可能是络气虚滞(过逸伤气)证候状态下血管内皮功能障碍发生发展的重要病生理学机制之一。同时,模型大鼠血清AECA含量显著升高、主动脉内皮细胞MHC-Ⅱ类分子以及ICAM-1、VCAM-1等粘附分子表达明显增强,这不仅是血管内皮损伤的免疫学基础,也是络气虚滞型血管内皮功能障碍发生的局部病生理学机制之一。证候因素在上述机制的产生中发挥关键作用,且与病理因素HHcy存在非线性叠加效应。4.血管内皮功能障碍是络气虚滞证候状态下的局部病理损伤中医学认为,任何一种疾病都是整体机能失调下的局部病理表现。本研究中单纯证候因素即可诱发大鼠全身性NEI网络调控失衡,同时表现出局部血管内皮受损与功能障碍,复合模型典型相关分析显示二者存在显著相关性,充分表明后者是络气虚滞证候状态下的局部病理损伤。络气虚滞证候可通过全身NEI网络紊乱加重血管损伤。此外,这一结果也提示改正不良生活习惯和方式,调整饮食结构及适当加强体育锻炼对于血管病变的防治具有重要现实意义。5.通络药物充分体现出对血管内皮功能障碍的整合调节优势三种不同类别通络方药均可明显改善复合模型大鼠络气虚滞证候,减轻内皮细胞损伤程度,有效保护血管内皮功能;同时,通络方药可不同程度地抑制复合模型大鼠下丘脑-垂体-肾上腺轴功能亢进、增强下丘脑-垂体-甲状腺轴功能、降低异常增高的免疫细胞因子,从而改善NEI调控网络的失衡状态,可显著降低模型大鼠血清AECA含量、抑制主动脉内皮细胞MHC-Ⅱ类分子以及ICAM-1、VCAM-1等粘附分子表达。上述对全身性NEI网络平衡以及局部内皮免疫损伤机制的调节可能是其改善络气虚滞型血管内皮功能障碍的关键作用机制。通络复方中药对机体多系统、多环节良性整合调节的系统效应,凸显中药既可有效改善“局部/血管内皮功能障碍”又能着眼“整体/气络-NEI网络”,较之阳性药单纯改变局部病理损伤更加具有治疗优势。6.细胞水平研究为深入阐明NEI网络中关键化学信号分子异常改变与血管内皮功能障碍密切相关的分子机制提供了实验依据本研究发现,TNF-α可通过p38 MAPK介导的信号转导通路诱导HUVEC细胞中ET-1的mRNA与蛋白表达;抑制eNOS mRNA与蛋白表达,从而导致血管内皮细胞功能失调,这为阐明NEI网络中关键化学信号分子异常改变与络气虚滞(过逸伤气)型血管内皮功能障碍密切相关的分子机制提供了实验依据。此外,通心络可显著降低TNF-α诱导的血管内皮细胞培养上清及细胞中ET-1的异常升高,增加eNOS的表达,从而有效保护内皮细胞,其机制与抑制p38 MAPK磷酸化和活化,进而影响p38 MAPK信号转导通路有关。