论文部分内容阅读
目的:探讨异甘草素(Isoliquiritigenin,ISL)是否可以改善Presenilin 1/2条件性双基因敲除(Presenilins conditional double knockout,PS cDKO)的阿尔茨海默病(Alzheimer disease AD)模型小鼠青壮年期焦虑样行为。同时深入研究ISL是否可以恢复PS cDKO小鼠海马CA1区锥体神经元上兴奋性突触传递与抑制性突触传递(Excitation/inhibition,E/I)平衡。最后探讨ISL是如何通过调节PS cDKO小鼠海马CA1区小清蛋白阳性(Parvalbumin,PV+)中间神经元的Kv1.1钾离子通道介导的钾电流,最终改善PS cDKO小鼠在青壮年期的焦虑样行为。方法:基于对PS cDKO小鼠异常的精神行为观察研究,我们综合运用全细胞膜片钳技术、行为学实验技术以及免疫荧光技术对PS cDKO小鼠焦虑样行为进行研究。(1)PS cDKO小鼠的繁殖与基因鉴定。(2)实验动物选用2.5月龄PS cDKO小鼠及其同窝野生型小鼠,雌雄各半,体重20 g左右,采用随机双盲分为四组:包括同窝野生型组(Wildtype,WT,n=16)、野生型+ISL组(WT+ISL,n=16)、PS cDKO组(cDKO,n=16)及PS cDKO+ISL组(cDKO+ISL,n=16)。WT+ISL组和cDKO+ISL组腹腔注射ISL(30 mg/kg,用0.2%DMSO稀释),WT组和cDKO组注射同等剂量0.2%DMSO稀释液,每天一次,共30 d,在3.5月龄时进行行为学实验,共持续7 d,期间一直给予药物治疗。分别利用旷场实验、明暗箱实验、糖水偏好实验观察PS cDKO小鼠与WT小鼠之间焦虑样行为的变化以及ISL治疗的作用。(3)采用全细胞膜片钳技术观察ISL治疗对WT和PS cDKO小鼠海马CA1区锥体细胞上突触传递的E/I平衡,包括自发性兴奋性突触后电流(Spontaneous excitatory postsynaptic current,sEPSC)和自发性抑制性突触后电流(Spontaneous inhibitory postsynaptic current,sIPSC),以及 ISL对微小抑制性突触后电流(Mini inhibitory postsynaptic currents,mIPSC)的影响。(4)PS cDKO小鼠和WT小鼠分别与特异性标记GABA能中间神经元绿色荧光的GAD67-GFP小鼠交配,繁育出cDKO-GAD小鼠。小鼠均为2.5月龄,雌雄各半,随机双盲分为四组,每组10只小鼠:包括WT:GAD组、WT:GAD+ISL组、cDKO:GAD 组、cDKO:GAD+ISL 组,WT:GAD+ISL 组和 cDKO:GAD+ISL 组小鼠腹腔注射ISL,剂量为30 mg/kg,用0.2%DMSO稀释。WT:GAD组和cDKO:GAD组给予腹腔注射同等剂量的0.2%DMSO稀释液,每天一次,治疗30 d后进行电生理实验。(5)采用全细胞膜片钳技术检测观察ISL治疗对PS cDKO小鼠海马CA1区中间神经元的动作电位发放、膜电阻、阈电位、静息电位、时间常数、钾离子通道等反映中间神经元兴奋性指标的影响。结果:(1)行为学检测结果显示:在旷场实验中,各组小鼠在旷场边缘区域活动的时间百分比没有差异;但PS cDKO小鼠活动的移动距离和移动速度明显高于WT小鼠,说明PS cDKO小鼠可能具有焦虑样行为,经过ISL治疗后有明显改善(P<0.05)。在明暗箱实验中,PS cDKO小鼠在明箱的活动时间和移动距离以及在明暗箱之间的穿梭次数均明显低于WT小鼠,提示PS cDKO小鼠具有焦虑样行为,通过ISL治疗后有改善作用(P<0.05)。糖水偏好实验中,各组小鼠消耗的糖水量没有明显差异,提示青壮年PS cDKO小鼠不具有抑郁样行为(P>0.05)。(2)通过全细胞膜片钳技术对各组小鼠海马CA1区锥体细胞的E/I电流检测发现,PS cDKO小鼠的sIPSC频率发放明显低于WT小鼠(P<0.01),幅度没有明显差异;而sEPSC的记录结果显示,无论频率还是幅度各组小鼠都没有明显差异;对sEPSC与sIPSC转移的电荷量的比较中,PS cDKO小鼠海马CA1区抑制性电荷转移量低于WT小鼠,兴奋性电荷转移没有明显差异,因此,PS cDKO小鼠海马CA1区E/I电流平衡比明显高于WT小鼠;然而,ISL治疗后可改善PS cDKO小鼠电荷量的转移平衡,从而降低PS cDKO小鼠E/I平衡的增高现象。海马CA1区锥体细胞mIPSC记录结果显示,PS cDKO小鼠mIPSC频率明显低于WT小鼠,幅度没有明显差异,但ISL治疗后不能改变PS cDKO小鼠的mIPSC频率。(3)GAD67-GFP小鼠与PS cDKO小鼠交配后采用全细胞膜片钳技术记录小鼠海马CA1区中间神经元动作电位,其结果显示:非快放电(Non fast-spiking)中间神经元动作电位阈值、静息膜电位、时间常数、输入电阻、动作电位幅度和动作电位持续时间在各组小鼠中无显著差异;而快放电(Fast-spiking)中间神经元的记录结果显示,cDKO:GAD小鼠海马CA1区动作电位阈值明显高于WT:GAD小鼠,ISL治疗后可降低cDKO:GAD的动作电位阈值(P<0.001),其余指标没有明显差异。(4)全细胞膜片钳技术记录结果显示,cDKO:GAD小鼠海马CA1区PV+中间神经元钾离子电流明显高于WT:GAD小鼠,ISL可减弱cDKO:GAD小鼠较高的钾离子电流(P<0.001);然而,用广谱钾离子通道阻断剂4-AP可阻断ISL的减弱作用;运用特异性Kv1.1钾离子通道阻断剂DTx-K验证Kv1.1电流变化,cDKO:GAD小鼠海马CA1区Kv1.1电流明显高于其他组,ISL可降低cDKO:GAD小鼠Kv1.1电流(P<0.01)。结论:(1)青壮年期的PS cDKO小鼠具有焦虑样行为,但不具有抑郁样行为,并且这种焦虑样行为是由于对神经元突触的抑制性功能损伤导致E/I平衡上升,ISL具有改善PS cDKO小鼠的焦虑样行为和恢复突触的E/I平衡的作用。(2)ISL通过降低PS cDKO小鼠海马CA1区PV+中间神经元动作电位的阈值提高其兴奋性,从而改善PS cDKO小鼠焦虑样行为。(3)ISL通过抑制PS cDKO小鼠海马CA1区PV+中间神经元Kv 1.1通道介导的钾电流以降低动作电位的阈值,最终改善PS cDKO小鼠的焦虑样行为。