【摘 要】
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第一部分 peb1A基因表达载体的构建及相应蛋白的表达目的 ：以基因工程技术构建编码空肠弯曲菌（CJ）粘附蛋白（periplasmic solute-binding protein，PEB1）编码基因peb1A的原核重组表达质粒，并获取目的蛋白，为进一步研究其生物学特性和制备CJ亚单位疫苗奠定基础。方法：（1）表达质粒的构建及鉴定：以含有BamHⅠ和Hind Ⅲ酶切位点的同一对引物行PCR反
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第一部分 peb1A基因表达载体的构建及相应蛋白的表达目的 ：以基因工程技术构建编码空肠弯曲菌（CJ）粘附蛋白（periplasmic solute-binding protein，PEB1）编码基因peb1A的原核重组表达质粒，并获取目的蛋白，为进一步研究其生物学特性和制备CJ亚单位疫苗奠定基础。方法：（1）表达质粒的构建及鉴定：以含有BamHⅠ和Hind Ⅲ酶切位点的同一对引物行PCR反应以获取七个血清株空肠弯曲菌的peb1A基因片段，测序比较其同源性。小量提取质粒pET32a（+）和pQE30，选择与GBS最为相关的Pen19 CJ 标准株PCR产物为目的片段，同时对目的片段和pET32a（+）、pQE30行双酶切反应；酶切产物纯化后连接，转染入大肠杆菌JM109，兰白斑和氨苄青霉素抗性平板筛选阳性菌落，重组质粒经双酶切和PCR反应鉴定后测序，分别命名为pET32a（+）-peb1A和pQE30-peb1A;（2）原核表达重组质粒在大肠杆菌中的表达及纯化:将重组质粒pET32a（+）-peb1A转化入大肠杆菌BL21（DE3），pQE30-peb1A转化入SG13009（pREP4）,IPTG诱导表达目的蛋白，超声破碎菌体，取上清用 Ni-NTA 树脂亲合层析纯化，SDS-PAGE<WP=5>鉴定；（3）融合蛋白鉴定：用CJ Pen19全菌抗原全身免疫雄性新西兰白兔，初次免疫后2、4、6、8、10周分别取血清观察特异性抗体滴度变化，用CJ Pen19粗提蛋白及纯化目的蛋白分别包被酶标板，ELISA法检测特异性抗体滴度，免疫印迹法鉴定抗体特异性。结果： （1）成功构建peb1A的表达质粒pET32a（+）-peb1A和pQE30-peb1A：PCR反应显示七种不同血清株CJ均在约780bp位置出现单一条带，测序表明多株间具高度同源性。双酶切和以重组质粒为模板的PCR反应鉴定，证明peb1A片段插入原核表达质粒pET32a（+）和pQE30中，测序表明插入位置正确；（2）重组质粒pET32a（+）-peb1A在大肠杆菌BL21（DE3）中成功表达出TrxA/PEB1融合蛋白，并通过亲和层析获取高纯度蛋白；而pQE30-peb1A却未表达相应的蛋白。（3）证实TrxA/PEB1融合蛋白有高度特异的免疫原活性： CJ Pen19全菌抗原免疫后4周在雄性新西兰兔诱发高滴度特异性抗体，可同时与Pen19菌体粗提蛋白和TrxA/PEB1蛋白发生特异性结合。免疫印迹法检测表明该抗体能与PEB1融合蛋白，但不与空质粒表达蛋白结合。结论 ：（1）运用基因工程技术,成功构建空肠弯曲菌peb1A的融合表达载体,并在大肠杆菌中诱导表达融合蛋白TrxA/PEB1；（2）所用表达质粒pET32a（+），获取的目的蛋白表达量大，有望用于今后基因工程技术中获取大量CJ粘附蛋白；（3）TrxA/PEB1基因表达蛋白具有与野生菌株相同抗原活性;（4）常见的7个CJ血清株均有大小相同的peb1A基因片段，测序证实不同血清型CJ peb1A基因间序列同源性高达94%- 96%，充分显示该基因序列的保守性；（4）PEB1融合蛋白作为CJ的亚单位侯选基因工程疫苗不仅可行，而且有良好应用前景。【关键词】 空肠弯曲菌,PEB1,原核表达,疫苗
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