耐高温酵母选育及突变株超高浓度乙醇发酵研究

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生产成本偏高一直是燃料乙醇产业发展的一大瓶颈,为此人们一直致力于研究和改进发酵工艺,建立新的发酵方法,降低生产成本,提高经济效益,其中采用耐高温乙醇酵母进行发酵具有很大的应用潜力,已成为国内外研究和探讨的热点。然而,要实现高温高浓度乙醇发酵,尚需要解决一些技术性难题。其中最大问题是发酵乙醇的生产菌株在高温胁迫下,会导致菌体老化和死亡,最终使发酵不能正常进行,因此,如何提高酵母菌的耐高温性能具有重要的意义。为此,本论文以自絮凝酵母SPSC进行诱变选育,获得可在高温和高浓度葡萄糖条件下进行发酵的优良突变株,并对其生理生化方面的变化进行研究,初步探讨酵母菌耐高温和高浓度葡萄糖双重胁迫的机制。实验首先采用紫外线(UV)和硫酸二乙酯(DES)作为诱变剂对原始菌株进行单因子和双因子的复合诱变处理。经多级筛选,最终获得两株在高温下能够正常发酵乙醇的突变株,编号分别为UD1和UD4。通过优筛实验,结果表明突变株UD1的发酵性能在各方面都略优于UD4。基于上述实验,选用突变株UD1为研究对象,采用均匀设计优化发酵条件,得出的各变量最佳组合为:葡萄糖330 g.L-1、接种量8.2×107 cells.mL-1、Ca2+ 1.1 mmol.L-1、Mg2+ 4.0 mmol.L-1、K+ 0.5 mmol.L-1、蛋白胨19.8 g.L-1、酵母浸出膏17.8 g.L-1。优化后的实验测得发酵终点乙醇浓度达到16.7% (v/v),比未优化时提高了34%,同时葡萄糖利用率提高了24.5%。在摇瓶发酵条件优化的基础上,针对酵母菌发酵能力和副产物甘油生成等方面在发酵罐水平进一步考察突变株UD1。实验结果表明,突变株UD1在5L发酵罐试验中,菌体表现出强劲的发酵活力,细胞存活率大幅度提高,发酵周期缩短至48 h,终点乙醇浓度达到16.8%(v/v),但副产物甘油含量却比未优化时高,这可能是因为甘油对其具有一定的保护作用。研究最后对突变株UD1的细胞膜脂肪酸组成、质膜ATP酶和细胞膜透性进行考察。结果表明:在5 L发酵罐试验中,突变株UD1的质膜ATP酶活力发酵12 h时达到最高峰值,明显高于出发菌株(亲本),同时细胞膜透性相对较低。采用GC-MS技术对突变株UD1的膜脂肪酸成分进行分析,结果显示,突变株UD1的膜脂肪酸占整个提取物含量的86.66%,而原始菌株仅有42.28%。在突变株UD1中,通过谱库检索,确切鉴定出六种脂肪酸,其中棕榈油酸、棕榈酸和油酸含量较高。而原始菌株通过谱库检索,鉴定出的物质绝大部分为酮类。实验结果表明,突变株UD1在高温胁迫下,各项生化指标均与原始菌株在同等条件下有明显差异。这些实验数据对帮助人们了解酵母菌耐高温机制具有一定的积极意义。
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