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鸡传染性喉气管炎病毒（Infectious Laryngotracheitis Virus,ILTV）属疱疹病毒科α疱疹病毒亚科,可引起鸡的传染性喉气管炎。早在1925年美国首次报道鸡传染性喉气管炎以来,在上世纪六十年代我国也发现了该病,相继在我国各省均有发生,该病是目前危害养禽业的重要疫病之一。国内外主要使用弱毒疫苗预防该病,但因疫苗株毒力普遍偏强,因此存在潜伏感染的危害以及无法鉴别疫苗株与野毒株的缺点。目前对ILTV基础研究较少,制约了鸡传染性喉气管炎防控技术的发展。本研究针对影响ILTV复制的关键宿主蛋白为切入点,首次鉴定到信号肽酶复合物亚基3（SPCS3）是影响ILTV在细胞中复制的关键宿主蛋白之一,发现SPCS3蛋白可以切割ILTV的gL蛋白。本研究内容及主要试验结果如下:1.分别对三株ILTV:SH2016、SH2017、GD2018的生长特性及致病性进行研究。三株ILTV均可在鸡肝癌细胞（LMH）增殖,感染ILTV后120h,SH2016滴度可达到103.08TCID50,SH2017和GD2018分别可达到103.42TCID50和105.08TCID50,其中GD2018较其它两株更适应LMH细胞生长;经绒毛尿囊膜方式接种9～11日龄SPF鸡胚,接种后168h,收取尿囊膜,SH2016滴度可达到103.25TCID50,SH2017和GD2018分别可达到102.67TCID50和104.33TCID50,GD2018更适应在尿囊膜上生长;收取尿囊液,SH2016滴度可达102.67TCID50,SH2017和GD2018分别可达到100.33TCID50和100.5TCID50,SH2017和GD2018不生长,SH2016可以在尿囊腔中复制。以尿囊腔方式接种9～11日龄SPF鸡胚,接种后168h,收取尿囊膜,SH2016滴度可达103.25TCID50,SH2017和GD2018分别可达到102.58TCID50和101.83TCID50;收取尿囊液,SH2016滴度可达104.58TCID50,SH2017和GD2018分别可达到101.25TCID50和100.67TCID50,即SH2017和GD2018几乎不生长,而SH2016更适应在尿囊腔中增殖。此外,分别用三株ILTV感染8周龄SPF鸡,SH2016临床症状最明显,是唯一引起鸡死亡的毒株,且三株ILTV只能在鸡喉气管组织中复制,其他脏器并未检测到;GD2018在攻毒后第14d,抗体效价最高,SH2016在攻毒后第21d抗体效价最高。2.分别对三株ILTV基因组进行高通量测序,拼接出全基因组序列,根据基因组结构,预测各蛋白序列。三株ILTV基因组长度分别为:SH2016为153.805kb、SH2017为153.024kb、GD2018为153.855kb;GC含量分别为:SH2016为48.16%、SH2017为48.06%、GD2018为48.10%。三株ILTV基因组结构均由UL、US、IRs及TRs四个区域组成。对病毒基因组核酸序列及10个编码蛋白氨基酸序列进行系统进化分析,基因组DNA进化树上,SH2016与俄罗斯分离株Rus/Ck/Tatarstan/1009/1643株亲缘关系最近,而与SH2017、GD2018关系较远;SH2017与美国分离株LT Blen亲缘关系最近;GD2018与俄罗斯分离株Rus/Ck/Penza/2013/2701及意大利分离株4784/80亲缘关系较近。g C及gL蛋白进化树中,三株ILTV在同一分支,该蛋白具有较高的保守性;gD、gE及gG蛋白进化树中,SH2016与GD2018在同一分支,同源性较高,而与SH2017同源性较低;gB、gH、gM、gI及TK蛋白进化树中,SH2017与GD2018同源性较高,而与SH2016同源性较低。对三株ILTV病毒10个蛋白氨基酸突变位点进行比较,发现除三株ILTV的gC蛋白序列完全一致外,其它9个病毒蛋白都有不同程度的氨基酸位点差异,这些蛋白差异疑与三株ILTV复制能力及致病性的差异相关。3.构建鸡全基因组CRISPR/Cas9敲除文库,对LMH细胞全基因组范围进行逐一扫描式敲除,构建基因敲除细胞文库,然后用ILTV感染细胞文库,对存活的细胞进行高通量测序,确定存活细胞中敲除的宿主基因。第一次测序结果发现3个非编码RNA（ncRNA）基因和SPCS3（信号肽酶复合物亚基-3）基因可能与病毒复制相关,随后的三次重复实验结果均显示,SPCS3基因是存活细胞中敲除率最高的基因,因此推测宿主蛋白SPCS3可能是影响ILTV复制的关键蛋白之一。4.比较ILTV在LMH细胞和SPCS3蛋白截短的LMH细胞系（分别命名为1-6和1-14）中的生长,在1-6细胞系中,ILTV的病毒滴度降低102.625倍,在1-14细胞系中,ILTV的病毒滴度降低103.75倍,表明SPCS3蛋白截短确实可以对ILTV的复制起到抑制作用。通过在线生物软件对ILTV中具有信号肽及多个跨膜结构的病毒蛋白进行预测,成功构建9个含有单一信号肽的病毒蛋白及4个含有多个跨膜结构的病毒蛋白真核表达质粒,转染细胞后,其中8个病毒蛋白成功表达,比较各病毒蛋白在LMH细胞及1-14细胞系中表达差异,结果显示,ILTV的衣壳糖蛋白L（gL）蛋白在两种细胞中的蛋白分子量差异明显,表明SPCS3蛋白截短影响了其切割gL蛋白的功能,这可能是影响ILTV复制的主要原因。5.为了解SPCS3蛋白截短对其它α疱疹病毒的影响,分别将鸭肠炎病毒（DEV）和人单纯疱疹病毒1型（HSV-1）两种α疱疹病毒感染LMH细胞和1-14细胞系,比较其生长差异。结果显示,与在LMH细胞上相比,DEV在1-14细胞系中病毒滴度降低102倍,而HSV-1在两种细胞上的生长无差异。进一步构建DEV和HSV-1两种病毒的gL蛋白真核表达质粒,分别转染LMH细胞和1-14细胞系后,两种病毒的gL蛋白在LMH细胞与1-14细胞系中,分子量大小无明显变化,但是DEV的gL蛋白在1-14细胞系中表达量明显低于LMH中的表达量,而HSV-1的gL蛋白在1-14细胞系种表达量没有明显变化,进一步表明截短的SPCS3可能影响gL蛋白的稳定性,从而影响DEV复制。本研究丰富了我国ILTV毒株全基因组序列生物学信息,明确了三株ILTV流行株的生物学特性。通过CRISPR/Cas9高通量筛选技术,筛选到一种与禽疱疹病毒复制相关的宿主蛋白分子,完善了ILTV复制中发挥关键作用的宿主蛋白作用机制,为ILTV致病分子机制研究尝试了新的思路。