【摘 要】
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随着经济社会发展和人民生活水平的显著提高,人们对稻米的需求发生了由“吃得饱”向“吃得好”的转变,水稻遗传育种改良也由“注重高产”向“优质、高产并重”转变。近几年分子生物学技术迅猛发展,以CRISPR/Cas9为首的定点基因编辑技术使稻米品质改良成为可能。本文通过利用CRISPR/Cas9基因编辑技术定点编辑水稻Waxy(Wx)和BADH2基因,从而改良水稻糯性和香味性状,并对编辑后的稳定株系进行详
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随着经济社会发展和人民生活水平的显著提高,人们对稻米的需求发生了由“吃得饱”向“吃得好”的转变,水稻遗传育种改良也由“注重高产”向“优质、高产并重”转变。近几年分子生物学技术迅猛发展,以CRISPR/Cas9为首的定点基因编辑技术使稻米品质改良成为可能。本文通过利用CRISPR/Cas9基因编辑技术定点编辑水稻Waxy(Wx)和BADH2基因,从而改良水稻糯性和香味性状,并对编辑后的稳定株系进行详细的品质和农艺性状考察分析。主要研究及结果如下:(1)对待敲除Wx基因的粳稻品种宁粳1号(NJ1)、籼稻品种华占(HZ)进行Wx基因型背景检测,检测结果表示宁粳1号、华占均为Wxb型;对待敲除BADH2基因的粳稻品种宁粳1号、籼稻品种黄华占(HHZ),以及三系不育系桃农1A进行BADH2基因型背景检测,检测结果显示,宁粳1号、黄华占为非香型水稻,桃农1A为香型不育系,其BADH2第8外显子存在5bp缺失、3bp突变。(2)利用VK005-1载体成功构建了上述两个目标基因的CRISPR/Cas9基因编辑表达载体,并进行遗传转化,成功获得基因编辑纯合株系。(3)纯合基因编辑株系表型鉴定,对敲除Wx基因的株系成熟籽粒进行0.02%I2-KI染色,结果显示,纯合编辑植株系种子被染成红紫色,而野生型种子被染成蓝黑色。成熟种子自然横断面扫描电镜发现,野生型的淀粉颗粒相比于敲除Wx基因株系淀粉颗粒规则且边缘锋利;敲除BADH2基因采用1.7%KOH浸泡叶片鉴定水稻香味,基因编辑纯合株系均能产生香味,而野生型无香味产生。(4)T0植株加代扩繁,利用PCR法和50mg/L潮霉素培养基筛选各编辑纯合株系中剔除转基因成分植株,同时分别对敲除Wx和BADH2的植株进行潜在脱靶位点检测。(5)对敲除Wx基因无转基因成分纯合株系进行稻米品质测定,发现敲除Wx基因的株系相对于其野生型直链淀粉含量极显著降低,总淀粉含量无明显变化,支链淀粉链长分布发生变化,胶稠度极显著增加。RVA谱分析显示,基因敲除株系均表现为较快达到峰值粘度(PV),随后又快速的下降并保持到低水平粘度。米粉尿素膨胀实验表明,米粉膨胀特性发生显著变化。(6)对敲除BADH2基因无转基因成分纯合株系进行香味物质2-AP测定显示,基因敲除株系中2-AP含量极显著高于野生型,野生型品种中均未检测到2-AP。稻米品质测定发现直链淀粉含量、胶稠度、RVA谱、米粉膨胀特性均未发生显著变化。糊化温度显示nj1-crBADH2-1与hhz-crBADH2-1相比对应野生型显著降低,其他株系未发生明显变化。(7)利用黄华占遗传背景下敲除BADH2基因无转基因成分纯合株系与桃农1A进行配组(B-TYXZ),以改良桃优香占(TYXZ)品种的香味性状。香味物质2-AP测定显示,B-TYXZ的2-AP含量极显著高于野生型桃优香占。相比于野生型TYXZ,B-TYXZ直链淀粉含量、糊化温度无显著变化,胶稠度极显著增加,新鲜米饭硬度极显著降低、胶黏性显著增加、回生米饭硬度极显著降低。食味仪外观评分与口感评分发生显著变化,综合评分未发生显著变化。(8)对改良香味的桃优香占(B-TYXZ)与野生型桃优香占(TYXZ)中γ-氨基丁酸(GABA)含量测定发现,B-TYXZ中GABA含量极显著低于野生型桃优香占。
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