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目的:阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD),俗称老年性痴呆,是一种起病隐匿与年龄相关联的中枢神经系统退行性疾病。近年来研究发现,磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶 B(phosphatidylinositol-3-kinase/protein kinase B,PI3K/AKT)、氧化应激下的磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)胰岛素和胰岛素样神经生长因子(insulin-like growth factor-1,IGF-1)的紊乱在神经退行性疾病发生发展中起着重要的调控作用。因此,调节该信号通路有可能是缓解AD的进展的方法之一。阿魏酸(Ferulic acid,FA)是一种存在于当归、木贼、川芎、升麻等多种植物中的酚酸类成分,具有良好的抗氧化活性和保护大鼠海马神经元损伤的作用。然而,阿魏酸发挥上述作用的机制仍不清楚,因此本文在细胞水平,评价阿魏酸对H2O2模拟氧化应激病理PC12细胞的保护作用,评价其神经元保护作用是否与调节IGF-1/IGF-1R/PI3K/AKT相关,并为阿魏酸治疗AD提供实验基础。方法:1.阿魏酸对H2O2诱导的PC12细胞氧化损伤的保护作用①氧化损伤剂量及时间的确定取对数生长期细胞,接种于96孔板中。培养24h后,分别用终浓度为(0、100、150、200、250、300、350、400、450μmol/L)的 H2O2分别刺激6h、12h、24h,筛选出抑制率在30%~40%的H2O2浓度,并以此浓度作为H2O2诱导PC12细胞损伤的作用浓度。②阿魏酸安全浓度的测定取对数生长期细胞接种于96孔板。培养24h后,弃去培养基,加入终浓度为(1、2.5、5、10、20、50、100、500μmol/L)的FA溶液,培养24h后,MTT法测定阿魏酸的安全浓度。③阿魏酸对H2O2损伤PC 12细胞的影响选用细胞活性抑制率在3 0%~40%的H2O2刺激PC12细胞,并评价安全浓度下的阿魏酸对PC12细胞形态和增殖的影响。采用MTT法检测FA对H2O2损伤PC12细胞增殖的影响,在倒置显微镜下观察细胞的数量及其形态变化。2.阿魏酸对H2O2诱导的PC12细胞氧化损伤的作用机制研究①实验分组分为正常组,模型组,阿魏酸低、中、高剂量组。除正常组外,各组均以350μmol/L的H2O2刺激,阿魏酸低、中、高剂量组在此基础上给予1、10和100μmol/L浓度的阿魏酸处理。②阿魏酸对氧化应激的影响H2O2、阿魏酸共培养36小时之后,收集细胞培养上清和细胞,测定上清液中LDH和MDA水平及细胞中SOD活力。③流式细胞术检测PC12细胞的凋亡率明确阿魏酸是否对H2O2损伤的PC12细胞具有保护作用。④RT-qPCR定量检测FA对H2O2诱导PC12细胞IGF-1、IGF-1R mRNA表达。⑤Western-blot检测PC12 细胞中 IGF-1、IGF-1R、PI3K、AKT、p-AKT 蛋白的表达情况。结果:1.350μmol/L浓度的H2O2能引起PC12细胞活率降低30%~40%,因此该浓度作为后续实验的刺激浓度。2.FA具有较高的安全浓度范围,在500μmol/L的浓度下未表现出明显的细胞毒性。3.FA降低H2O2诱导的PC12细胞的氧化损伤与正常对照组相比,模型组的细胞存活率明显下降(P<0.01),细胞的数量减少,细胞形态皱缩或者变圆;FA给药干预后,各给药组细胞数量和形态较模型组明显增加和改善,大剂量药物作用下与模型组相比,细胞存活率显著增加(P<0.01),上清液中LDH水平明显降低(P<0.01)。4.FA减轻H2O2导致的氧化应激与正常对照组相比,模型组中MDA的含量显著升高(P<0.01),SOD酶的活力明显降低(P<0.05),与模型组对比,给药组明显降低MDA含量(终浓度为100μmol/L时有显著性,P<0.05)同时能够显著提高SOD酶的活力(P<0.01)。5.FA对H2O2诱导的PC12细胞凋亡的影响实验结果表明,与正常对照组相比,在H2O2刺激下,PC12细胞出现明显的凋亡(P<0.01),阿魏酸干预后,PC12细胞凋亡率显著降低,表明阿魏酸具有抑制细胞凋亡的作用,差异具有统计学意义(P<0.01)。6.FA对IGF信号通路的影响RT-qPCR实验结果表明,与正常对照组比较,模型组中PC12细胞IGF-1、IGF-1R mRNA表达明显降低(P<0.01),而细胞经FA处理后,IGF-1 mRNA明显增高(P<0.01),且呈明显的量效关系;IGF-1R mRNA均有升高,且在大剂量下差异具有统计学意义(P<0.05)。Western-blot实验结果表明,与模型组相比,阿魏酸均能上调PC12细胞中IGF-1/IGFlR/PI3K/AKT/pAKT的蛋白表达水平。表明,阿魏酸发挥神经保护机制可能与调控胰岛素介导的经典胰岛信号通路中各相关蛋白有关。结论:1.FA对体外培养的H2O2诱导的PC12细胞具有良好的保护作用,可以促进H2O2损伤的PC12细胞的增殖,保护细胞膜的结构完整性,减少细胞因外界刺激而发生的形态改变,降低细胞上清液中LDH的漏出率和MDA的含量,同时增强细胞内SOD酶的活力,增强细胞的抗氧化能力,抑制细胞的氧化损伤。2.FA具有降低PC12细胞因氧化应激导致的细胞凋亡,从而发挥神经保护作用3.FA能显著上调IGF-l、IGF-1R mRNA以及胰岛信号通路相关蛋白IGF-1、IGF-1R、PI3K、AKT、p-AKT蛋白的表达水平,揭示FA能改善胰岛信号通路转导,调节能量代谢,从而起到神经保护作用。