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研究背景:甲基苯丙胺(Methamphetamine,METH俗称“冰毒”,是一种新型合成毒品。因其见效快、兴奋持续时间长、价格低以及合成技术简单等特点,已成为全球滥用排名第二的毒品。METH滥用对多器官具有毒性损伤作用,其中对中枢神经系统的毒性损伤作用尤为突出。大量的临床资料表明,METH可对大脑神经元产生直接的损害作用,导致神经元变性、坏死,并出现一系列急慢性功能障碍。一直以来,关于METH神经毒性损伤的研究往往与其导致神经细胞凋亡及自噬相关,但对METH诱导的神经元程序性坏死则未见报道。研究表明程序性坏死(Necroptosis)与多种疾病的发生发展有关,包括创伤、缺血/再灌注损伤、神经退行性变等。因此我们对METH是否可以导致神经元发生程序性坏死及其机制进行了探索,发现METH可以引起程序性坏死关键信号分子受体相关作用蛋白激酶-3(Receptor-interacting protein kinase 3,RIP3)表达升高及活化,但RIP3 是怎样介导METH诱导的神经元程序性坏死呢?目的:本课题拟探讨RIP3在METH诱导的多巴胺能神经元程序性坏死的分子机制,旨在明确了 RIP3在METH介导的细胞程序性坏死中的作用,完善和补充METH介导的细胞死亡的机制,为METH神经毒性损伤机制研究及基因干预提供理论依据。方法:本课题拟从吸食METH死者的脑组织标本入手,通过形态学观察确定METH能引起神经元发生坏死。通过构建体内、外METH染毒模型,使用特异性抑制剂,慢病毒干扰干预RIP3的表达及活化。采用HE染色,免疫组化染色,Western Blot,TUNEL染色,免疫荧光等技术检测干预前后RIP3的表达情况,及其下游信号通路分子的变化情况探讨RIP3在METH诱导的神经元程序性坏死作用。结果:1.吸食METH死者纹状体区域出现噬神经现象,表明了 METH可以促进神经元发生坏死,同时检测到RIP3蛋白的表达升高。2.METH染毒小鼠模型纹状体区域中也发现了类似现象,同时高表达RIP3蛋白的区域,神经元死亡数量也明显升高,表明了RIP3在METH诱导的细胞程序性坏死中起了关键作用。3.敲低RIP3表达后,纹状体区域神经元死亡数量得到了恢复,而且pMLKL(S345)和pDRP1(S616)蛋白表达以及外周血血浆中NSE含量,线粒体分裂均降低,RIP3可能通过激活下游蛋白MLKL和DRP1来介导细胞发生程序性坏死。4.METH可引起原代多巴胺能神经元中RIP与RIP3相互作用并激活RIP3同时激活下游的MLKL蛋白,从而破坏细胞膜引起细胞程序性坏死。5.激活的DRP1会移位到线粒体中,引起线粒体分裂增多,线粒体膜电位下降,ROS产生增多等紊乱现象从而介导细胞发生程序性坏死。结论:RIP3在METH诱导的多巴胺能神经元程序性坏死起了关键性作用,为METH的神经毒性治疗提供可能的分子干预靶点。