研究背景及目的绝经后骨质疏松症是有一类在绝经后五到十年的妇女中发病率相对比较高的骨质疏松症,它以低骨量、低骨强度为特性。PMO主要原因是绝经后体内激素大量下降,导致破骨细胞过度活化,进而患者出现骨质疏松症。当今医疗水平提高,人均受命增高,老年人数量剧增,这些都使得骨质疏松症成为影响社会发展和人民生活质量的难题。骨质疏松症是一种常见的代谢性骨病,它的特点是骨质蛋白和矿物质含量的过度流失并伴随着骨质密度的下降以及骨骼支撑力度的减弱。尽管骨质疏松症很流行,但治疗该疾病的药物并不理想。尽管雌激素、双膦酸盐和狄诺塞麦据报道对骨质疏松症有效,但相关的不良反应,如血栓栓塞、食管刺激和颌骨坏死,使得这些药物在骨质疏松的治疗使用受限。因此有必要为其开发更安全有效的药物。了解到在骨重建失衡中,最重要的具有骨吸收功能的细胞一般认为是破骨细胞,过度的骨吸收将会使骨量减少,骨强度下降进而导致骨质疏松,因此人们认为起源于骨髓的破骨细胞是导致骨质疏松等破坏性骨骼疾病的罪魁祸首。成年以后,一方面成骨细胞不断生成骨,另一方面破骨细胞不断吸收骨,两者维持平衡,这个过程就是骨重构。通过骨重构,一方面可以维持骨骼系统的相对稳定,以便发挥其支撑、保护和运动功能,另一方面可以维持肌体的平衡。为了寻求一种安全有效的抗骨质疏松药物,我们从100种FDA批准的针对破骨细胞分化的药物进行筛选,从中发现奥利司他（Orlistat）具备增加患者骨量防止骨质疏松的作用,之后我们进行了预实验,实验结果排除了奥利司他通过细胞毒性来抑制破骨细胞生成。然而,奥利司他是否切实可以被用来治疗类似于骨质疏松症的破骨细胞相关性疾病的研究仍是一片空白,分子学机制仍不清楚。我们希望能够通过相关实验来探明奥利司他在体外条件下是否能抑制RANKL诱导的OC分化与生成,以及它是否可以在体内环境下减少卵巢切除小鼠的骨量下降,同时探寻这一系列作用背后的分子生物学机理。研究方法一、在体外水平研究奥利司他对破骨细胞的影响（1）观察奥利司他对体外破骨细胞增殖能力的影响,明确其对破骨细胞分化的抑制不是由其潜在毒性所引起;（2）在同一时间点,应用不同浓度的奥利司他处理体外破骨细胞,明确奥利司他浓度与抑制程度之间的相关性;（3）分别在破骨细胞分化的第1,3,5天应用同一浓度的奥利司他处理,明确其抑制破骨细胞分化的时间依赖方式;（4）观察奥利司他对破骨细胞肌动蛋白环成环能力的影响,明确其对破骨细胞骨架结构的影响;（5）应用骨吸收形成实验方法,观察奥利司他对分化成熟OC骨吸收活性的影响。二、在体内水平研究奥利司他对OVX小鼠骨量的影响（1）分别设立sham、OVX、OVX+奥利司他组,应用micro CT观察用药12周后奥利司他对骨流失的影响;通过von kossa染色确定骨量是否受影响;（2）分别设立sham、OVX、OVX+奥利司他组,应用骨组织TRAP染色法观察奥利司他对破骨细胞骨吸收活性的影响。（3）分别设立sham、OVX、OVX+奥利司他组,应用骨组织Goldner染色法观察奥利司他对成骨细胞骨活性的影响。三、阐明奥利司他抑制破骨细胞分化的分子机制研究结果一、在体外水平奥利司他对破骨细胞的影响（1）MTS比色结果显示对于两种原代细胞,奥利司他浓度小等于10u M范围内,培养细胞的增殖未受到抑制,此时的奥利司他未对BMMs和RAW264.7表现出细胞毒性。（2）奥利司他浓度越高,观察到的TRAP阳性MNC单核细胞越少,表明奥利司他以剂量依赖性方式抑制破骨细胞生成。（3）在指定时间点向破骨细胞分化培养基中加入同一浓度的奥利司他。结果说明,在分化初期加入奥利司他可以最大限度地抑制破骨细胞形成,而后期加入奥利司他的抑制作用较弱。（4）奥利司他干预后,观察到RANKL诱导的BBMs细胞中肌动蛋白带的面积和数量显著减少,这说明奥利司他可以抑制肌动蛋白环的形成,且呈浓度依赖型。（5）凹坑形成实验显示,在RANKL的刺激下,SHAM组产生了许多大而深的吸收凹坑然而,奥利司他干预后,牙本质切片上的骨凹深度和面积显著降低。二、在体内水平研究奥利司他对OVX小鼠骨量的影响（1）经奥利司他处理12周后,应用micro CT观察发现,破骨细胞表面/骨表面积（Oc S/BS）和侵蚀表面/骨表面（ES/BS）等相关指标水平有一定程度的逆转。（2）通过骨免疫组化TRAP染色和血清的ELISA检测实验结果证明奥利司他可在一定程度上抑制破骨细胞骨吸收活性。（3）通过骨组织Goldner染色法观察奥利司他对成骨细胞骨活性的无明显影响。三、阐明奥利司他抑制破骨细胞分化的分子机制（1）奥利司他可以通过抑制核因子抑制蛋白的降解来抑制核因κB受体活化因子配体刺激的核因子κB活化。同时奥利司他可以抑制核因κB受体活化因子配体刺激的丝裂原活化蛋白激酶的激活,这种抑制是通过抑制核因子抑制蛋白降解和ERK、JNK和p38的磷酸化实现的。进而表明奥利司他作用于前体细胞以下调核因κB受体活化因子配体诱导的破骨细胞特异性转录因子的表达,从而减少随后的破骨细胞分化。结论这是一项前瞻性研究,结果表明奥利司他能够通过抑制NF-κB和MAPK信号通路在体外和体内抑制破骨细胞生成,表明奥利司他是治疗类似与绝经后骨质疏松症这样的破骨细胞生成疾病的前景可观的候选药物。本次的成果也许可以丰富奥利司他的临床治疗谱。