环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是根据靶基因6个不同区域进行4种特异引物设计,并通过恒温环境以链置换DNA聚合酶为反应条件,实现核酸体外扩增反应的技术。非洲猪瘟(African Swine Fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African Swine Fever Virus,ASFV)引起的一种急性、烈性、高度接触性传染病,致死率高达100%。本研究基于LAMP技术建立了ASFV现场可视化快速检测的方法。欧洲毒株基因(即格鲁吉亚2007/1株)与报道的中国辽宁省沈阳市沈北新区某养殖场发生的非洲猪瘟病毒序列完全匹配,我们以此为靶序列构建非洲猪瘟病毒质粒,设计LAMP引物F3、B3、LF、LB、FIP、BIP。通过进行引物优化、温度优化、时间优化以及体系优化实验,建立了基于环介导等温扩增技术检测非洲猪瘟病毒的方法,具有较好的特异性。采用5种不同的模板浓度对该方法的灵敏度进行试验。结果显示:灵敏度实验中最低检测限为2拷贝,检测时间仅需20分钟,检测结果可根据颜色判断,进行现场可视化检测。此外,基于LAMP技术,还建立了一种快速检测牛性别的方法。分别设计LAMP的雌雄共有引物和雄性特异引物,进行后续LAMP方法的研究。采用公牛和雌牛的血液DNA作为模板,通过优化反应时间、温度、引物比例和体系,建立了环介导等温扩增技术检测牛早期胚胎性别的方法。采用9种不同浓度的模板对方法的灵敏度进行检测,结果显示:雌雄共有引物可检测的最低浓度为2pg/μL,雄性特异引物可检测的最低浓度为5pg/μL。特异性实验显示牛的样品与羊和猪的样品无交叉反应,雌雄共有引物和雄性特异引物检测准确率为100%。表明该检测方法灵敏度高以及特异性强。重组酶聚合酶扩增技术(Recombinase Polymerase Amplification,RPA)是利用重组酶和单链结合蛋白在常温下协同实现引物与模板的特异结合,以代替传统PCR热循环中的变性和复性过程的新型恒温体外核酸扩增技术。本研究建立了基于重组酶聚合酶扩增技术检测牛性别的方法。根据牛的保守区基因序列,分别设计了RPA的雌雄共有引物和雄性特异引物,利用性别不同的牛、羊和猪的样品对该方法的特异性进行验证;并采用7种不同浓度的模板对该方法的灵敏度进行检测。特异性结果显示:雌雄共有引物能检测到雌牛和公牛样品,而雄性特异引物只能检测到公牛样品,说明牛的样品与羊和猪的样品无交叉反应。在灵敏度实验中,雌雄共有引物可检测的最低浓度为1pg/μL,雄性特异引物可检测的最低浓度为2pg/μL,则RPA的灵敏度高于LAMP。基于RPA技术的牛性别检测方法特异性强,灵敏度高,检测时间只需5分钟,不需要特殊的仪器设备,操作便捷。综上所述,本研究共建立了三种检测方法,分别是基于LAMP技术的非洲猪瘟病毒检测和牛性别鉴定方法以及基于RPA技术的牛性别鉴定方法。三种方法均有较强的特异性和较高的灵敏度,反应时间短,适用于实验室或者现场快速检测。