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目的:探讨溶酶体-线粒体途径在氧化应激诱导的人宫颈癌细胞死亡过程中的作用及其机制。方法:(1)MTT法检测VK3诱导Hela细胞损伤过程中的细胞生存率;电镜观察细胞超微结构;DCFH-DA免疫荧光方法检测细胞内活性氧的水平;Hoechst33342免疫荧光方法检测细胞凋亡,RT-PCR、Western blot检测凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax mRNA和Cyt C及caspase3蛋白的表达及自吞噬相关蛋白Beclin 1、LC3-II蛋白的表达。(2)AO染色检测溶酶体的稳定性、Rhodamine 123染色检测线粒体膜电势的变化; RT-PCR检测mTOR信号转导途径p70S6K mRNA、线粒体分裂融合基因mRNA表达的变化和Western blot检测Akt、mTOR蛋白的表达;MDC荧光染色检测自噬泡的聚集。(3)BCECF-AM荧光染色流式细胞仪分析Hela细胞损伤时细胞浆的pH变化。结果:(1)MTT检测VK3 (15μM、30μM、60μM)作用人子宫颈癌Hela细胞6h,12h,24h细胞生存率逐渐降低,并呈剂量时间相关性;细胞内活性氧增加;Hoechst33342染色检测VK3组细胞核呈现凋亡细胞核形态;RT-PCR和Western blot结果显示,VK3能引起Hela细胞Caspase-3、CytC蛋白表达增强以及Bax/Bcl-2 mRNA比值明显增高;同时发现VK3能引起Hela细胞自吞噬相关蛋白Beclin 1、LC3-II表达增加;电镜结果显示VK3能引起Hela细胞内自噬泡聚集。(2)与对照组比较,溶酶体稳定性在VK3作用Hela细胞3h开始降低、线粒体膜电势在作用6h开始降低,Akt、mTOR及mTOR底物p70S6K mRNA表达和磷酸化Akt和mTOR蛋白表达减低,线粒体分裂融合基因Mfn1、Opa1、MTP18 mRNA表达下降,而Mfn2、Drp1及Fist1 mRNA变化不明显;(3)与VK3组比较,联合应用VK3和NAC后,抑制了细胞的溶酶体稳定性、线粒体膜电势降低,Akt、mTOR及mTOR底物p70S6K mRNA表达和磷酸化Akt和mTOR蛋白表达均无明显降低。各组线粒体分裂融合基因表达无明显变化;(4)联合应用VK3和NH4Cl组细胞生存率降低,凋亡细胞数量增多,溶酶体膜稳定性及线粒体膜电势明显降低,磷酸化的Akt和mTOR蛋白表达明显下降,Drp1和MTP18 mRNA表达明显降低,Mfn1、Opa1基因表达增高,Mfn2和Fist1无明显变化,自噬泡数量增加,caspase3蛋白表达增高。(5)BCECF-AM荧光染色结果显示,与对照组相比,VK3组Hela细胞损伤时细胞浆的pH值降低。与VK3组比较,联合应用VK3和NAC组细胞浆pH值降低不明显;联合应用VK3和NH4Cl组细胞浆pH值明显降低。结论:(1)通过观察VK3诱导的Hela细胞氧化应激损伤时,caspase3裂解片段增多;cytosolic cyt C蛋白释放增加;Bax mRNA表达逐渐增强;Bcl-2 mRNA表达逐渐减弱;细胞核呈现典型凋亡形态;Beclin 1蛋白表达逐渐增强;LC3-II蛋白表达逐渐增强;细胞内自噬泡形成,联合应用VK3和NAC后活性氧的释放率减少;凋亡细胞核表现和自噬泡减少;提示VK3诱导Hela细胞死亡中,除了与I型程序性细胞死亡(凋亡)有关外,可能也与自噬有关。(2)通过观察不同时间点VK3诱导Hela细胞死亡过程,发现细胞浆红色荧光减弱、绿色荧光增强,说明溶酶体稳定性出现下降,而且溶酶体膜稳定性下降开始于VK3作用后第3h,线粒体膜电势下降开始于第6h。联合应用VK3和NAC后,溶酶体膜稳定性的及线粒体膜电势的下降均不明显;说明在VK3诱导的Hela细胞氧化应激损伤时,溶酶体稳定性降低先于线粒体膜电势下降,表明VK3可能通过影响溶酶体后导致线粒体损伤。(3)通过观察VK3诱导的Hela细胞氧化应激损伤时,Akt,mTOR和p70S6K基因表达明显下降;磷酸化Akt(ser-473)和mTOR(ser-2481)蛋白的表达明显下降;联合应用VK3和NH4Cl后,磷酸化的Akt和mTOR蛋白表达下降更明显;联合应用VK3和NAC后, Akt,mTOR和p70S6K基因和磷酸化的Akt和mTOR蛋白表达的下降不明显,提示在VK3诱导的Hela细胞死亡过程中, Akt/ mTOR信号途径的变化可能参与了I型程序性细胞死亡(凋亡)和自噬的发生过程。(4) VK3诱导的细胞氧化应激损伤时,细胞线粒体融合基因Mfn1和Opa1及线粒体分裂基因MTP18 mRNA表达明显降低;联合应用NAC可以抑制VK3诱导的Mfn1、Opa1及MTP18基因表达降低,表明线粒体融合基因和分裂基因表达异常可能与氧化应激诱导的细胞损伤有关。(5)联合应用VK3和NH4Cl后,与单独应用VK3相比,MTT结果显示细胞生存率明显降低,溶酶体稳定性明显下降,线粒体膜电势也明显降低。Mfn1、Opa1基因表达增加,Drp1和MTP18 mRNA表达明显降低,提示NH4Cl可能具有协同VK3诱导氧化应激细胞的溶酶体及线粒体损伤作用,导致溶酶体稳定性明显下降及线粒体融合基因和分裂基因mRNA表达异常,进一步表明溶酶体影响线粒体细胞死亡途径是氧化应激诱导Hela细胞死亡的主要机制。溶酶体与线粒体之间的平衡对细胞生存具有十分重要的影响。(6)通过观察联合应用NH4Cl和VK3的细胞内自噬泡聚集明显增多,凋亡相关蛋白caspase3表达增高,提示NH4Cl可能抑制了自噬泡和溶酶体的融合过程,进而凋亡作用增强。(7) VK3诱导的细胞氧化应激时, FL1/FL2比值降低,细胞浆pH值降低,酸性pH的细胞数增多(13.6%)。联合应用VK3和NAC,FL1/FL2比值增高,细胞浆pH值升高,酸性pH的细胞数减少(5.4%)。联合应用VK3和NH4Cl,FL1/FL2比值明显降低,细胞浆pH值明显降低,酸性pH的细胞数明显增多(43.8%),提示氧化应激诱导Hela细胞死亡可能与细胞浆酸化有关。细胞酸化即可能是细胞凋亡的伴随现象,同时又可能导致溶酶体、线粒体损伤,加重溶酶体-线粒体途径引起的细胞死亡,其机制有待于进一步研究。