【摘 要】
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目的:根据本课题组以前的实验研究,老鼠簕生物碱A（4-羟基苯并[d]恶唑-2（3H）-酮,HBO）具有良好的保护肝脏功效。然而,HBO对LPS/D-Gal N所致的急性肝损伤的影响尚未被研究,其潜藏机制仍不清楚。因此,本研究的目的在于探讨HBO能否减轻LPS/D-Gal N诱导的急性肝损伤程度。此外,本研究还探讨了HBO是否通过影响TLR4/NF-κB和MAPK途径而发挥其肝保护作用。方法:将60
【基金项目】
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项目名称:基于TGF-β/Smads通路及ADAMTS-2蛋白表达对老簕生物碱A抗肝纤维化作用机制的研究,项目合同编号:81660106,项目来源:国家自然科学基金,项目起止时间:2017年01月-2020年12月
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目的:根据本课题组以前的实验研究,老鼠簕生物碱A（4-羟基苯并[d]恶唑-2（3H）-酮,HBO）具有良好的保护肝脏功效。然而,HBO对LPS/D-Gal N所致的急性肝损伤的影响尚未被研究,其潜藏机制仍不清楚。因此,本研究的目的在于探讨HBO能否减轻LPS/D-Gal N诱导的急性肝损伤程度。此外,本研究还探讨了HBO是否通过影响TLR4/NF-κB和MAPK途径而发挥其肝保护作用。方法:将60只C57BL/6J雄性小鼠按照随机分配原则,分成六个小组:正常对照组、急性肝损伤模型组、联苯双酯滴丸阳性对照组、HBO高剂量给药组、HBO中剂量给药组和HBO低剂量给药组。阳性组小鼠灌胃给予联苯双酯滴丸150 mg/kg/d,HBO高中低给药组分别灌胃注入HBO 200、100和50 mg/kg/d,正常对照组和模型组小鼠全都灌胃给予溶剂0.5%CMC-Na,预处理10天。10天后,除了正常对照组外,其余小鼠腹腔注射LPS（10μg/kg）和D-Gal N（700 mg/kg）,6小时后,处死所有小鼠,收集并且保存好血清和肝脏,以进行之后的实验分析。取血清样本,检测ALT、AST和TBIL水平。制作肝脏样本切片,进行HE染色用以观察肝脏组织病理学变化;采用TUNEL染色法观察肝脏中肝细胞的凋亡程度;此外,用免疫组化方法检测c-jun在肝脏中的表达。ELISA法检测肝组织匀浆中TNF-α和IL-1β的水平。用试剂盒测定肝匀浆中NO、i NOS、MDA、GSH-PX、GSH、SOD和CAT的活性。采用RT-PCR方法检测TNF-α、IL-1β、TLR4、NF-κBp65、NF-κBp50、ERK、p38、JNK和c-jun的m RNA水平。WB法检测肝组织中TLR4/NF-κB信号通路、MAPK信号通路和凋亡相关蛋白的表达。结果:1 HBO对LPS/D-Gal N所致急性肝损伤有保护作用H＆E染色显示正常对照组肝脏结构正常,肝细胞排列有序,无病理损伤区。但模型组出现了以大面积坏死、出血和炎症浸润为特征的结构破坏。与模型组比较,HBO治疗组均得到缓解,明显降低了坏死面积的百分比。与正常组比较,模型组血清AST、ALT和TBIL水平显著升高,而HBO治疗后使其水平有所降低;模型组中GSH、GSH-PX、SOD和CAT水平显著降低,而MDA、NO和i NOS含量明显增加,但是LPS/D-Gal N引起的这些变化被HBO治疗逆转。因此,HBO可减轻LPS/D-Gal N所致急性肝损伤的严重程度。2 HBO减轻炎症反应和正常组相比,模型组TNF-α和IL-1β的含量显著增加,而HBO治疗显著降低了这些炎症细胞因子的过度表达以及其m RNA水平的增高。这提示HBO可以减弱LPS/D-Gal N所致急性肝损伤的炎症反应。3 HBO减轻LPS/D-Gal N诱导的肝细胞凋亡TUNEL结果图片显示,LPS/Gal N诱导肝细胞大量凋亡,而HBO治疗明显降低了这些作用。WB结果显示,LPS/D-Gal N治疗显著上调了促凋亡蛋白BAX和BAK的表达,HBO治疗后BAX和BAK的表达降低,此外,我们检测到抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xl的表达情况与促凋亡蛋白相反。并且正常组的线粒体与胞浆Cyt C的比率明显高于模型组,然而,HBO治疗有效地恢复了这一比率。说明HBO对细胞凋亡有较强的抑制效果。4 HBO抑制TLR4/NF-κB通路的激活与正常对照组相比,LPS/D-Gal N处理的小鼠肝脏NF-κBp50、TLR4和My D88的蛋白表达水平以及IKK-α/β、IκB和NF-κBp65的磷酸化水平明显升高。HBO治疗后,上述NF-κBp50、TLR4和My D88的表达及IKK-α/β、IκB和NF-κBp65的磷酸化均显著降低。并且LPS/D-Gal N显著增强了TLR4、NF-κBp65和NF-κBp50的m RNA表达,而HBO治疗抑制了这些基因的m RNA表达。以上结果表明HBO可影响LPS/D-Gal N诱导的TLR4/NF-κB通路中重要因子的激活。5 HBO抑制MAPK信号通路的激活WB结果显示,与正常组相比,LPS/D-Gal N使模型组小鼠肝组织中MEK、ERK1/2、JNK和p38的磷酸化水平显著提高,经HBO处理后这些蛋白的表达明显受到抑制。免疫组化实验中,正常组的肝脏切片显示c-jun仅微弱表达,在LPS/D-Gal N的刺激下,c-jun的表达明显增高,HBO组c-jun的表达显著低于模型组。另外,经过LPS/D-Gal N处理后,ERK1/2、JNK、p38和c-jun m RNA表达明显增强。然而,用HBO治疗可显著降低这些因子的m RNA水平。说明HBO可能通过影响MAPK通路关键蛋白的活化来减轻LPS/D-Gal N诱导的急性肝损伤。结论:本实验研究阐明,HBO可以使LPS/D-Gal N诱导的小鼠急性肝损伤严重程度有所好转。HBO改善了肝脏结构损伤,逆转ALT、AST和TBIL水平的异常,具有良好的抗氧化能力,并且能够抑制炎症反应,其机制可能与影响TLR4/NF-κB和MAPK信号通路中的主要因子有关。
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