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目的:本课题研究杨桃根中提取的单体2-十二烷基-6-甲氧基环己-2,5-二烯-1,4-二酮(DMDD)对乳腺癌和肝癌小鼠皮下移植瘤的影响,探讨其潜在的作用机制。方法:1.DMDD对乳腺癌小鼠皮下移植瘤的作用及其机制的研究选择60只Balb/c小鼠,皮下注射乳腺癌4T1细胞建立小鼠移植瘤模型。每日观察肿瘤生长情况,当肿瘤生长到100 mm~3时,从中挑选50只随机分为5组:模型组,多柔比星(DOX)组,DMDD低剂量(DMDD-L)组,DMDD中剂量(DMDD-M)组和DMDD高剂量(DMDD-H)组,另取10只未造模的小鼠作为正常组。给药14天,小鼠处死取材,血清采用酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒检测白介素2(IL-2)、白介素4(IL-4)和白介素10(IL-10)。采用HE染色和透射电子显微镜观察肿瘤组织病理变化情况,TUNEL染色检测DMDD诱导细胞凋亡的能力。采用RT-q PCR检测RAF1、MEK1/2、ERK1/2、Bax和Bcl-2的m RNA表达量,通过免疫组织化学法对p-RAF1、p-MEK、p-ERK进行半定量分析,蛋白免疫印迹法(WB)检测蛋白RAF1、MEK、ERK、JNK、P38、p-RAF1、p-MEK、p-ERK、p-JNK、p-P38、Bax和Bcl-2的表达水平。2.DMDD对肝癌小鼠皮下移植瘤的作用及其机制的研究选择45只裸鼠,皮下注射肝癌Bel-7404细胞建立裸鼠移植瘤模型。每日观察肿瘤生长情况,当肿瘤长到100 mm~3时,从中挑选40只随机分为5组:模型组,DOX组,DMDD-L组,DMDD-M组和DMDD-H组,另取8只未造模的小鼠作为正常组。给药12天,小鼠处死取材,分析瘤体,瘤重和抑瘤率评价其抗癌作用,脾脏和肝脏称重,计算脏器指数。血液用来检测白细胞(WBC),红细胞(RBC),血红蛋白(HGB)和血小板(PLT)。ELISA试剂盒检测IL-2、IL-4、IL-10、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、转化生长因子-β1(TGF-β1)和血管内皮生长因子(VEGF)。采用HE染色和透射电镜观察肿瘤组织病理变化情况,TUNEL染色检测DMDD诱导细胞凋亡的能力。采用RT-q PCR检测RAF1、MEK1/2、ERK1/2、Bax和Bcl-2的m RNA表达量,通过免疫组织化学法对p-RAF1、p-MEK、p-ERK、Bax和Bcl-2进行半定量分析,WB检测蛋白RAF1、MEK、ERK、JNK、P38、p-RAF1、p-MEK、p-ERK、p-JNK、p-P38、Bax和Bcl-2的表达水平。结果:1.DMDD对乳腺癌小鼠皮下移植瘤的作用及其机制的研究(1)与模型组相比,DMDD给药组的肿瘤体积较小;DMDD给药组的瘤重小于模型组(P<0.05或P<0.01);DOX组、DMDD-L组、DMDD-M组和DMDD-H组的抑瘤率分别为:41.9%,26.59%,37.06%,43.80%。(2)与模型组比较,DMDD给药组的IL-2表达升高,IL-4和IL-10表达降低(P<0.05或P<0.01)。(3)HE染色结果,模型组:癌细胞排列紧密,体积较大,细胞核呈多形性,核仁明显;DOX组和DMDD给药组:细胞数量减少,排列疏松,核固缩。(4)透射电镜观察结果,模型组:细胞核大,核仁明显,细胞器完整,出现中心体;DOX组:细胞皱缩,体形呈波纹状,核浓缩,染色质凝集及边缘化,大量空泡形成;DMDD-H组:细胞皱缩和碎裂,核凝结,染色质凝集,出现凋亡小体。(5)TUNEL染色结果,DMDD给药组的阳性凋亡细胞率高于模型组和DOX组(P<0.05或P<0.01)。(6)RT-q PCR结果,与模型组比较,DMDD给药组的RAF1、MEK1/2、ERK1/2和Bcl-2的m RNA表达降低,Bax的表达升高(P<0.05或P<0.01)。(7)免疫组织化学法结果,与模型组比较,DMDD给药组的p-RAF1、p-MEK和p-ERK的表达降低(P<0.05或P<0.01)。(8)WB结果,与模型组比较,DMDD给药组的p-RAF1、p-MEK、p-ERK、p-JNK、p-P38和Bcl-2的蛋白表达水平下调,Bax蛋白的表达上调。2.DMDD对肝癌小鼠皮下移植瘤的作用及其机制的研究(1)与模型组相比,DMDD给药组的肿瘤生长缓慢;DMDD给药组的瘤重小于模型组(P<0.01);DOX组、DMDD-L组、DMDD-M组和DMDD-H组的抑瘤率分别为:49.38%、47.36%、63.13%和66.39%。(2)与模型组比较,DMDD给药组的肝脏指数无差异,而脾脏指数下降(P<0.01)。(3)与模型组和DOX组比较,DMDD给药组的WBC、HGB和PLT的含量升高(P<0.05或P<0.01)。(4)与模型组比较,DMDD给药组的IL-2、IL-4、IL-10、TNF-α、TGF-β1和VEGF表达降低(P<0.05或P<0.01)。(5)HE染色结果,模型组:癌细胞体积较大,排列紧密,核仁明显;DOX组和DMDD给药组:细胞排列疏松,数量减少,细胞核固缩。(6)透射电镜观察结果,模型组:细胞核大,核仁明显,染色质分布均匀;DOX组:核浓缩,染色质凝聚及边缘化,大量空泡形成;DMDD-H组:细胞核皱缩,染色质凝集及边缘化,出现大量空泡和凋亡小体。(7)TUNEL染色结果,DMDD给药组的阳性凋亡细胞率高于模型组(P<0.05或P<0.01)。(8)RT-q PCR结果,与模型组比较,DMDD给药组的RAF1、MEK1/2、ERK1/2和Bcl-2的m RNA的表达降低,Bax的表达升高(P<0.05或P<0.01)。(9)免疫组织化学法结果,与模型组比较,DMDD给药组的p-RAF1、p-MEK、p-ERK和Bcl-2的表达下调,Bax的表达上调(P<0.05或P<0.01)。(10)WB结果,与模型组比较,DMDD给药组的p-RAF1、p-MEK、p-ERK、p-JNK、p-P38和Bcl-2的蛋白表达水平下调,Bax蛋白的表达上调。结论:DMDD能诱导乳腺癌小鼠皮下移植瘤细胞的凋亡,其机制可能与其增强小鼠的免疫功能,调控MAPK通路有关;DMDD能诱导肝癌小鼠皮下移植瘤细胞的凋亡,其机制可能与DMDD能增强小鼠的免疫功能,改善血常规指标,降低细胞因子的分泌,调控MAPK通路有关。