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Fat-1基因来自于秀丽隐杆线虫,其编码产物脂肪酸脱氢酶可将n-6多不饱和脂肪酸(n-6 PUFAs)转化成n-3多不饱和脂肪酸(n-3 PUFAs)。n-6 PUFAs和n-3 PUFAs在机体内的平衡对于稳定细胞膜功能、促进生长发育、维持细胞因子和脂蛋白平衡、抗心脑血管病、抗炎、抗癌等方面起着重要的作用。然而,大多数膳食原料中n-3 PUFAs含量较少,不能够满足大众营养需求。采用转基因方法制备富含n-3 PUFAs的转基因猪是解决n-3 PUFAs来源的有效方法之一。目前虽有一些Fat-1转基因猪研究报道,但外源基因都是以随机插入方式整合到染色体上,通常会导致外源基因表达不稳定。并且这些Fat-1转基因猪通常携带标记基因,存在生物安全问题。因此,本研究旨在制备Fat-1定点整合且不含标记基因的转基因猪。Rosa26基因首次在小鼠胚胎干细胞中发现,在成年小鼠各组织和胚胎期均有表达,被认为是外源基因插入的安全位点。本实验利用CRISPR/Cas9介导的同源重组技术,将Fat-1基因定点整合到猪Rosa26位点,通过体细胞核移植技术获得Fat-1定点整合转基因猪。分离新生仔猪尾尖成纤维细胞,进行染色体计数,结果显示Fat-1定点整合转基因猪存在38条染色体,数目正常。为进一步确定Fat-1基因没有发生非特异性整合,提取猪耳部组织基因组进行Southern blot拷贝数检测,结果表明,Fat-1基因在转基因猪体内为单拷贝,没有发生非特异性整合。将性成熟F0代阳性母猪与野生杜洛克公猪配种,得到7头F1代仔猪,其中3头为Fat-1定点整合仔猪,说明Fat-1基因能稳定遗传给后代,并且实时定量PCR结果显示Fat-1基因在F1代各个组织中均有表达。通过气相色谱法对肌肉组织脂肪酸组成进行分析,以野生型猪为对照,Fat-1转基因猪体内ALA、DPA、DHA等n-3 PUFAs含量显著增加,LA、AA等n-6多不饱和脂肪酸含量显著下降,从而导致其体内n-6PUFAs/n-3PUFAs比例从9.36下降到2.12(***P<0.0001)。本研究获得了富含n-3 PUFAs的Fat-1转基因猪,对提高猪肉的营养价值具有重要意义,并且能为研究n-3 PUFAs的功能和作用机制提供合适的动物模型。