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家蚕微粒子虫（Nosema bombycis）是一种从家蚕中分离的单细胞真核病原体,能引发对蚕业具有毁灭性危害的微粒子病（Pébrinee）,因其感染潜伏期长,且可以在家蚕个体之间进行水平传播和经卵垂直传播,成为了蚕业生产中唯一的检疫对象。因此,微粒子病的防治成为了蚕业研究的热点。从上个世纪开始,研究学者就期望通过抗性育种的方式来防治微粒子病,但至今还未在生产上出现对N.bombycis具有抗性的家蚕品种。家蚕及家蚕微粒子虫基因组测序的完成推进了家蚕分子育种的进程。在前期研究中,本实验室基于RNA干涉（RNA interference,RNAi）和表达单链抗体（Single chain variable fragment,sc Fv）的家蚕微粒子虫抗性素材创建策略进行了初步尝试。本研究基于家蚕微粒子虫的特殊侵染增殖方式,将分子靶标聚焦于其胞内增殖期的膜蛋白,初步筛选出了一批抗性素材创建的潜在靶点。主要研究结果如下:1.家蚕微粒子虫侵染宿主早期高表达膜蛋白基因的筛选基于本实验室前期已获得的感染家蚕微粒子虫的家蚕中肠转录组数据及家蚕微粒子虫基因组数据库,对微粒子虫发育早期的具有膜定位信息的高表达基因进行筛选,初步获得了9个高表达假定膜蛋白,分别是NBO＿32g0046、NBO＿76g0014、NBO＿76g0007、NBO＿28g0050、NBO＿555g0004、NBO＿73g0021、NBO＿7g0021、NBO＿81g0016、NBO＿29g0022。对这些候选基因进行转录验证,所筛选的9个假定膜蛋白基因在微粒子虫感染细胞后均能转录,且转录水平都较高。预测每个基因的最佳si RNA片段后,将通过体外合成的ds RNA瞬时转染Sf9细胞,转染后6h添加微粒子虫,在感染3d和5d提取细胞样品的RNA和g DNA,通过q PCR检测感染样品中靶基因的表达情况及Nbβ-tubulin的拷贝数以反映细胞的感染程度,结果显示,NBO＿32g0046,NBO＿7g0021,NBO＿76g0014和NBO＿555g0004在干涉5d后能显著抑制微粒子虫增殖,将其作为后续研究的靶标。2.稳定干涉细胞系的建立对NBO＿32g0046、NBO＿7g0021、NBO＿76g0014和NBO＿555g0004转录情况进行调查,发现在感染N.bombycis的细胞中,4个候选靶标均从感染早期就开始表达,且在8 h～3 d表达量整体呈上升趋势,在第4 d表达量较低,可能是微粒子虫在感染第4 d形成成熟孢子,4 d～6 d又开始了新一轮的侵染。在感染N.bombycis的家蚕中肠中,上述4个靶标基因在感染前期表达量低,在感染3 d后持续并显著上升。以pSL1180[pIE1-Antisense-A3intron-Sense-SV40]为骨架载体,以“头”对“头”的方式将上述靶标的干涉片段连接到该载体上,验证成功后通过单酶切的方式将整个表达盒连接到piggy Bac[A3-Neo+IE2-Ds Red]转基因载体上,将验证正确的重组质粒与辅助质粒（pHA3PIG）通过脂质体介导法共转至Sf9细胞,经G418压力筛选获得了能稳定表达干涉片段的转基因细胞系。3.候选靶标蛋白的多克隆抗体制备及定位分析采用原核表达的方式获取上述候选靶标的重组蛋白,构建了其原核表达载体。分别进行诱导表达后,通过亲和层析获取了NBO＿7g0021,NBO＿76g0014和NBO＿555g0004的重组蛋白,但未获得NBO＿32g0046重组蛋白。将获得的重组蛋白免疫BALB/c小鼠制备特异性多克隆抗体,最终获得了NBO＿76g0014和NBO＿555g0004的效价高、特异性好的多克隆抗体。通过间接免疫荧光实验（Indirect Immunofluorescence Assay,IFA）证明NBO＿76g0014在N.bombycis孢原质、裂殖体中定位于膜上,且裂殖体中与Nbtubulin存在部分共定位,在感染N.bombycis的中肠中,其定位信号位于孢壁内侧。免疫电镜（Immunoelectron Microscopy,IEM）的结果也显示NBO＿76g0014为N.bombycis的膜蛋白。NBO＿555g0004的定位与NBO＿76g0014相似,也将其列为N.bombycis的膜蛋白。4.NBO＿76g0014单克隆抗体的制备通过杂交瘤技术制备了针对N.bombysic膜蛋白NBO＿76g0014的单克隆抗体,NBO＿76g0014重组蛋白进行ELISA筛选后,获得了能持续分泌抗体的一株细胞株F12,其抗体亚型为Ig G1-κ,免疫印迹结果显示F12可识别孢子总蛋白及感染细胞总蛋白中的NBO＿76g0014蛋白。克隆获得了F12的抗体轻链和重链可变区片段,轻链及重链可变区中均含有3个完整的互补决定区（CDR）,并通过桥式PCR技术获得了其单链抗体基因sc Fv-F12。构建了含有hr3增强子的sc Fv-F12表达盒,并将其连接到piggy Bac[A3-Neo+IE2-Ds Red]载体中,成功构建了sc Fv-F12转基因表达载体,为后续单链抗体的表达及利用奠定基础。