肝脏是人体重要的消化器官,参与人体生命活动的多种功能:包括糖原代谢、脂肪代谢、氨基酸代谢、胆汁酸代谢、解毒和代谢体内废物等新陈代谢功能来维持身体内稳态平衡。肝细胞占肝脏的大部分以及参与肝脏大多数功能,例如有内源性和外源性血液蛋白和凝血因子的合成,储存糖原,氨基酸,脂肪和铁,以及胆汁的分泌。肝脏疾病包括乙肝,肝硬化和肝细胞癌（HCC）在内的疾病是世界范围内重要的健康问题,每年因不同肝脏疾病死亡人数非常高,对人类生活和社会发展构成巨大威胁。因此,对阐明肝脏发育及其细胞和分子机制具有重要意义。肝脏起源于腹部前肠内胚层。肝脏特化后,肝脏祖细胞从内胚层剥离并侵入隔膜并横贯间叶形成肝芽。随后肝芽通过细胞增殖和体积扩增进行生长发育。肝脏祖细胞分化为两种类型的上皮细胞,每种类型排列成独特的结构,具有独特的功能。肝脏中的两种主要上皮细胞类型是肝细胞和胆管上皮细胞,两者源自肝脏形成过程中的祖细胞即就是成肝细胞。肝细胞构成肝脏的大部分细胞结构,而胆管上皮细胞形成胆管网络。这两种细胞在肝脏中空间分布上被分隔开,胆管毗邻于门静脉和肝动脉,位于肝脏门静脉区域,也称为“肝门三联体”。肝细胞广泛的分布在肝“小叶”中,肝小叶是肝脏的功能单元。哺乳动物的胆管系统由肝内胆管和肝外胆管组成,其主要功能是把胆汁从肝脏转运送到肠道。胆管功能障碍可导致胆汁在肝脏内积聚,阻碍肝脏代谢物的排泄,最终导致肝损伤,如Alagille综合症、胆道闭锁等先天性胆道疾病。胆道的形成需要细胞间相互作用的协调,从而调节胆管上皮细胞的分化和形态建成。斑马鱼属于硬骨鱼,其肝脏与哺乳动物肝脏具有不同的组织学特征。其门静脉、肝动脉,胆道在肝实质中随机分布,但不像哺乳动物那样在门管区有序排列。斑马鱼肝细胞围绕胆小管,而不是在哺乳动物中出现的双层排列肝细胞板。肝内胆管由胆管和胆管形成胆道网络组成,胆汁通过大管道和肝外胆道系统在胆囊内收集。斑马鱼的肝脏结构与哺乳动物有些差异,但是最基本的细胞类型是一样的,如肝细胞和胆管上皮细胞这两大类群细胞。斑马鱼肝脏具有非常强大的再生能力,在剧烈的急性损伤条件下依然能够快速的重新建立起新的肝脏来满足机体的需求,在整个的再生过程中,胆管系统作为新生的肝脏细胞来源,通过转分化而实现肝脏的再生。斑马鱼的胆管系统包含两部分,分别是肝内胆管和肝外管,两者的发育来源不尽相同:肝内胆管是由肝脏祖细胞分化而来的,肝外管是由肝胰管的祖细胞产生的,两者个祖细胞均来源于内胚层细胞,肝脏内外胆管一起共同构成完整的胆管网络。得益于斑马鱼的模式动物优势,可以进行大规模的ENU化学诱导突变体筛选,从而使我们获得想要的目的组织器官突变体。在本实验室中,nap突变体就是我们筛选的有关胆管发育表型的突变体,通过传代获得胆管转基因背景,方便进行体外的表型观察以及机制研究。我们对nap突变体表型通过标记胆管上皮细胞alcam的抗体染色和标记肝内胆管的分子标记基因anxa4、cldn15a1b原位杂交检测,我们从而把对nap突变体的关注点放在了肝脏内胆管的发育问题上,这类关于胆管分化缺失的突变是比较少见的。经过定位克隆技术,从而把nap的突变位点定位到14号染色体上,经过进一步的染色体步移,把突变位点所处的片段大小缩小到0.1Mbq其区域内仅剩下5个备选基因,然后通过外显子的测序我们发现frmpd3基因的第16号外显子上发生了碱基的点突变,致使所编码的氨基酸也发生了改变,通过注射frmpd3基因的Morpholino观察胚胎胆管的表型从而确定了frmpd3基因的突变造成nap突变体表型。至于引起nap突变体肝内胆管缺失的原因大致可以分为两个,一个是胆管已经分化存在,由于胆管上皮细胞发生凋亡从而导致发育后期胆管的缺失,通过细胞TUNEL染色我们否定这一解释;另外一种情况就是肝脏祖细胞向胆管上皮细胞分化时受阻从而导致肝脏祖细胞不能正常向胆管上皮细胞分化从而导致胆管的缺失,经过我们检测确认了这种情况,也就是说nap突变体的胆管缺失表型是由于肝脏祖细胞向胆管上皮细胞分化受阻导致的。那么到底是什么信号导致的胆管上皮细胞不能正常的被分化,我们检测了最直接影响肝脏胆管分化的notch信号,发现notch信号的配体jagged1b、受体notch1a/b以及靶基因hes5a均发生了明显的下调,说明nap突变体的胆管上皮细胞分化是由于突变体中notch信号的下调导致的。并且jagged1b在人类和斑马鱼中突变后同样会造成肝内胆管数目的减少与nap突变体的表型类似,因此我们推测两者之间可能有某种联系。我们通过体外转录合成了jagged1b的细胞膜外蛋白的编码序列,并在突变体胚胎中注射jagged1b m RNA后,我们发现nap突变体的胆管缺失表型可以得到部分回救,相比正常肝脏内胆管数目还是有所减少。从而说明了nap突变体的胆管缺失表型是由于jagged1b/notch信号的下调导致肝脏祖细胞向胆管上皮细胞分化受阻,进而导致nap突变体发育后期胆管缺失的表型。本实验通过大规模的化学诱变筛选,得到与肝内胆管缺失相关的突变体nap,并通过定位克隆、基因编码蛋白序列碱基测序找到了突变基因frmpd3,并对其进行内源性敲降,所产生的表型与nap突变体表型一致,则确认了frmpd3就是nap突变体的突变基因。对nap表型的进一步研究确认了胆管缺失是由于胆管上皮细胞分化受阻导致的。由于notch信号是最直接的影响肝内胆管分化的信号,通过检测notch信号通路基因的变化得到在突变体中notch信号通路相关基因均明显下调,通过用jagged1b m RNA做回救实验发现其可以回救nap胆管缺失的部分表型,说明了frmpd3是通过jagged1b/notch信号来调控肝脏祖细胞向胆管上皮细胞的分化,同时在人类中由于jagged1b突变所产生的阿拉吉欧综合征的表型和nap的表型相似,通过研究nap突变体的发育分子机制也许可以为这种疾病提供理论和临床的帮助。