脓毒症(sepsis)是指由各种感染因素介导的全身性炎症反应综合征(systemic inflammatory response syndrome,SIRS),是严重感染、大手术和休克、重度创伤和烧伤等急危重患者的严重并发症之一。病情进一步发展可导致急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)、脓毒性休克(septic shock)和多器官功能障碍综合征(multiple organ dysfunction syndrome,MODS)等。尽管目前脓毒症受到国内外高度关注,研究也比较多,对脓毒症的发病机制也有部分了解,但是临床上还是缺乏针对细菌脓毒症的有效防治措施,所以关于脓毒症的根本发病环节及作用机制尚有待深入研究。盲肠结扎穿孔(cecal ligation and puncture,CLP)模型模仿临床上阑尾炎穿孔或憩室炎穿孔的特点,并一直被认作是脓毒症研究动物模型的“金标准”。该方法的原理主要是通过引起腹腔混合细菌感染,继而诱发急性腹膜炎导致脓毒症。该模型不仅能够准确模拟人类脓毒症时脂多糖(lipopolvsaccharide,LPS)持续攻击机体这一病理状态,而且能很好的反映由肠源性感染导致的脓毒症的发病过程;模型中肝、肺组织炎症因子、内毒素水平显著升高,炎症反应剧烈,肝、肺、肠等组织损伤严重,是目前理想的研究脓毒症的实验动物平台。高迁移率蛋白B1(high mobilityg roupbox1,HMGB1),一种广泛存在的、高度保守的细胞核非组蛋白,其功能主要表现为在细胞核内参与核蛋白质复合体的组成、基因转录调节等;当其释放至胞外时,则可作为晚期致炎因子介导炎症反应。另外在HMGB1刺激下,巨噬细胞、单核细胞等可以分泌TNF、IL-1、IL-6等致炎细胞因子。在早期的研究中,科学家们也发现Toll样受体介导的信号转导途径是脓毒症早期炎症激活及促炎反应的重要路径。此外HMGB1能够通过与Toll样受体、晚期糖基化终末产物受体(receptor for advanced glycation end products,RAGE)等细胞表面受体结合,激活下游信号通路,参与晚期炎症反应。但其介导的晚期脓毒症细胞信号通路机制目前还不是很清晰。关于HMGB1及其受体介导信号通路机制的研究仍然有待深入。众所周知,蛋白质是生命活动的执行者,是细胞最主要的功能执行者,对感染性休克过程中蛋白质信息的解析,差异蛋白质组学可以为我们提供一个很好的支持。差异蛋白质组学能通过比较不同样本之间蛋白质表达水平的变化,从而寻找差异分子,最后鉴定差异蛋白质。随着差异蛋白质组学研究技术的不断革新,使得我们可以在机体生理、病理过程中,从整体水平研究肝脏蛋白质组的变化成为可能。目前已经产生了许多新的技术,其中包括荧光差异双向凝胶电泳(Two-dimensional fluorescence difference gel electrophoresis,2D-DIGE)技术;该技术的原理是:用不同的荧光染料进行标记不同的样品,同时在每一块凝胶中引用内标,同时进行电泳。内标的引入排除了组内、组间差异,确保结果能反映出真实的生物学差异,增加了可信度。另外由于DIGE技术不仅继承了二维凝胶电泳高通量、高动态范围等优势,而且提高了分辨率,目前已经成为蛋白质组学最常用的实验平台之一。本实验取野生型Wild-type和RAGE knock-out型C57/BL6小鼠若干,分别施以假手术(sham)和脓毒症模型(CLP),分为W-Sham、W-CLP、KO-Sham和KO-CLP四组,8h后颈部放血处死小鼠,提取肝脏蛋白质,随后利用蛋白质组学2D-DIGE技术平台,对四组小鼠肝脏组织蛋白质组进行分离,使用MALDI TOF/TOF生物质谱技术对差异蛋白质进行鉴定,经过数据分析筛选所得到20多种差异蛋白质,文献报道,hnRNPK被发现在许多肿瘤组织中均高表达,已有研究证实其在胰腺癌、肺癌、前列腺癌等多种肿瘤细胞和组织中呈过表达;在慢性粒细胞白血病进入急变期时,hnRNPK的表达也会增加。其主要通过调控与细胞增殖有关的基因表达而影响肿瘤的发生发展。由此可见,包括hnRNPK在内的hnRNP家族成员在各种肿瘤发生、发展与转移中的具体机制值得深入研究,而氧化应激、慢性炎症等与各种疾病的形成与发展密切相关,在炎症中关于hnRNPK的研究也较少,由此最终确定核内不均一核糖核蛋白K(heterogeneousnuelear ribonucleoprotein K,hnRNPK)为所感兴趣的目标蛋白质,进行进一步的功能探讨。虽然蛋白质是细胞最主要的功能执行者,但是其在机体并不是单独发挥作用的,机体每一个生理活动都是由众多蛋白分子共同参与并协作来完成的,各蛋白质成员之间通过共价键、盐键、疏水作用等彼此相互作用而聚集成大的蛋白质功能单元,共同完成各种生理活动,通常将这样的大蛋白分子的集合称作“多蛋白质复合物”(multi-protein complexes,MPCs)。细胞在不同生理及病理状况下,受蛋白质表达水平、亚细胞器定位和修饰状态等变化的影响,发挥各种生理功能的蛋白质复合体的组成也往往处于动态变化之中,但是这些变化恰恰能够直接阐明细胞对各种时空条件的反应机制。因此,研究MPCs组成成分及其动态变化将有助于加深对细胞生物学功能事件发生发展的分子机制的认识。传统的蛋白质-蛋白质相互作用研究技术包括:酵母双杂交技术、串连亲和纯化技术、荧光共振能量转移技术等,然而这些系统均有一定缺陷。这些方法需要对起始材料进行必要的加标签操作,可能会对某些在生理条件下发生的蛋白质相互作用产生影响。1991年,Schagge等为了研究哺乳动物和真菌线粒体中的蛋白质复合体,建立了温和凝胶电泳系统即蓝色非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(blue native PAGE,BN-PAGE),电泳之前在蛋白质样品中加入考马斯亮蓝G-250,使蛋白质带上负电荷,从而不破坏蛋白质复合体内部的结构,使蛋白质复合体,在近似天然状态下进行分离,具有广泛适用性。常用于分离膜蛋白复合物、蛋白质-蛋白质相互作用和胶内活性检测等多个领域的研究。前期2D-DIGE技术分离结果表明hnRNPK在W-CLP/W-Sham组表达上升而KO-CLP/KO-Sham下降,然而hnRNPK在蛋白质、RNA水平变化是否与DIGE结果一致;以及在脓毒症前后几组小鼠肝脏的损伤情况如何;hnRNPK在小鼠肝脏细胞分布情况以及在细胞内的定位情况,以及hnRNPK都是以怎样的蛋白质复合体形式在脓毒症中发挥作用。本文针对这些问题开展了以下实验,首先运用HE染色方法,观察野生型与RAGE敲基因型C57/BL6小鼠假手术与不同时间CLP模型组,小鼠肝脏的损伤情况;蛋白质、RNA水平检测小鼠肝脏表达情况变化,验证与2D-DIGE结果是否一致;然后利用组织、细胞免疫化学实验观察hnRNPK在小鼠肝脏细胞分布情况以及细胞内的表达与定位情况;接着在不同时间点给予AGE刺激,观察hnRNPK蛋白质复合体的聚集与移位情况;最后利用BN-PAGE联合质谱技术的方法,分离、鉴定hnRNPK相关蛋白质复合物。纵观整个实验方案及结果,我们可以得出以下几点结论:1.不同组别小鼠肝脏组织HE染色结果显示:野生型假手术组小鼠肝脏组织结构正常,肝细胞排列整齐;而野生型CLP模型组小鼠肝脏炎性细胞广泛浸润,肝细胞变性、局部融合性坏死,且随着脓毒症时间增长受损加重,但是RAGE敲基因型小鼠,脓毒症后肝脏损伤有所减弱;2.Western blot、Q-PCR结果表明:在野生型小鼠组,脓毒症后hnRNPK蛋白表达上升;但是在RAGE敲基因型小鼠组,hnRNPK蛋白表达反而下降,与DIGE结果变化一致;3.组织免疫化学IHC结果表明:hnRNPK在小鼠肝脏肝细胞、巨噬细胞等细胞广泛分布;4.细胞免疫荧光结果显示:hnRNPK在Raw264.7细胞、HepG2细胞胞浆、胞核均有表达,且主要分布在胞核;hnRNPK在细胞内形成聚集体,但是在给予AGE刺激后,并无观察到明显的移位现象;5.BN-PAGE结果显示:LPS刺激Raw264.7细胞有明显蛋白质复合体形成。BN-PAGE技术的出现为近似天然状态下进行分离蛋白质复合体提供了可能,通过DIGE分离技术与MALDITOF/TOF质谱鉴定技术相结合与敲基因小鼠的运用的方法,可以为我们提供一种寻找靶向蛋白质的方法。