应激（stress）指机体在受到各种内外环境因素刺激时所出现的非特异性全身反应，心理应激是机体通过认识、评价而察觉到应激原的威胁时引起的心理、生理机能改变的过程。随着社会发展和竞争压力的增加，心理应激已成为一个威胁人类健康不可忽视的重要因素。慢性心理应激在心脑血管病、内分泌疾病、神经精神疾病和自身免疫性疾病的发生中起重要作用，使机体出现正常衰老过程加速、学习记忆障碍、应激性精神紊乱、痴呆、抑郁症、免疫力低下等多系统疾患，其中抑郁症是临床最常见的身心疾患之一。本病属于中医“郁证”范畴，其病机的核心是由于肝郁而造成郁证。肝为刚脏，五行归木，“体阴而用阳”，喜条达，恶抑郁，主疏泄。肝主疏泄通过调节气机、血和津液而调畅情志。情志变化过激，出现肝失疏泄、气机逆乱，造成一系列心身反应疾病，所以心理应激反应成为研究肝主疏泄调畅情志功能的神经生物学机制的切入点，而应用中医学肝主疏泄理论进一步探讨抑郁症的病因学机制和抗抑郁治疗药物的研究具有十分重要的意义。中医藏象及七情学说认为不良环境或精神刺激与疾病的发生发展密切相关，病理性的心理应激反应即属于中医学所述情志异常的范畴，肝失疏泄所致生理病理改变的发生发展在一定程度上也是一种病理性的心理应激反应，即肝主疏泄功能在调节心理应激反应和抑郁症的防治中具有重要作用。本研究室长期以来从事肝主疏泄调畅情志功能的中枢神经生物学机制研究和探讨，取得了重要的研究成果和进展。近年重要工作是结合中医整体观和平衡观以及现代心理应激理论，以心理应激反应为切入点，提出中医学肝主疏泄调畅情志的功能存在着一定具体的神经生物学机制，并用方、证、效、脏腑功能本质的研究思路，通过建立慢性心理应激反应模型模拟肝失疏泄、情志异常的综合病理变化过程，根据实际病理变化组方用药体现出疏肝，柔肝，平肝以及清肝的综合调治的思想，通过调肝方药加味四逆散在治疗上的药物效应来进一步反证和揭示肝主疏泄，调畅情志功能的有关神经生物学机制。本研究立足于以往研究基础，结合目前国内外的相关研究，在细胞和分子水平进一步探讨调肝方药加味四逆散治疗效应的微观物质基础。实验选用具有神经元特性和功能的PC12细胞，利用皮质酮（Cort）、谷氨酸（Glu）作用于体外培养的PC12细胞作为研究模型，体外模拟抑郁症病人出现的高糖皮质激素（GC）水平及谷氨酸堆积状态，运用中药血清药理学方法、流式细胞术、免疫荧光、免疫印迹等方法，针对慢性心理应激可导致对神经细胞损伤这一关键问题，观察调肝治法方药加味四逆散含药血清的药物学效应，从微观方面阐明和揭示调肝治法方药抗慢性应激致神经细胞损伤的机理，为今后研制开发抗抑郁症中药新药提供理论依据。本研究分为四部分：第一部分加味四逆散含药血清对皮质酮、谷氨酸致PC12细胞损伤的保护作用抑郁症病人有不同程度的情绪紊乱以及神经精神系统的损伤，长期处于应激状态，HPA轴功能持续亢进，机体处于高水平的糖皮质激素状态。抑郁症发生后兴奋性氨基酸谷氨酸堆积，导致神经元变性，引起海马神经元的凋亡和死亡，甚至出现大脑功能形态损害。本部分实验观察调肝方药加味四逆散（JWSNS）含药血清对皮质酮、谷氨酸致PC12细胞损伤的保护作用。加味四逆散组方为柴胡5g、白芍15g、枳壳6g、枸杞子15g、山栀5g、干地黄18g、石决明30g组成。实验选用SPF级雄性wistar大鼠，将动物随机分为对照组、JWSNS低、中、高剂量组（分别含生药剂量0.846、1.69、3.384kg／L）。腹主动脉取血，分离制备含药血清。用倒置显微镜对培养的PC12细胞、皮质酮、谷氨酸、JWSNS含药血清作用PC12细胞24h后的细胞进行形态观察，用形态学方法证明PC12细胞培养成功。采用100、200、400μmol／L Cort、10、50、100μmol／LGlu及5％、10％JwSNS含药血清分别与PC12细胞共同孵育24h，以MTT法测定细胞存活率，观察不同浓度皮质酮、谷氨酸及加味四逆散含药血清对PC12细胞生长的影响，结果显示100μmol／L、200μmol／L、400μmol／Lcort组细胞存活率分别为72.31％、53.85％、26.16％，10μmol／L、50μmol／L、100μmol／L谷氨酸组细胞存活率分别为67.69％、43.32％、21.54％，不同浓度皮质酮和谷氨酸对PC12细胞的生长均具有抑制作用，随着皮质酮和谷氨酸的浓度升高，细胞存活率明显降低，细胞损伤程度加重，与正常细胞对照组相比均有显著性差异（p＜0.05-0.001）。5％JWSNS含药血清低、中、高剂量组细胞存活率分别为86.76％、98.41％和94.11％，10％JWSNS含药血清低、中、高剂量组细胞存活率分别为85.29、97.06％和89.71％，50石、10％正常血清组细胞存活率分别为92.65％和88.24％，与正常细胞对照组细胞存活率相比均无差异（P＞0.05）。表明加味四逆散含药血清对正常PC12细胞无毒副作用。选取200μmol／LCort、50μmol／LGlu为损伤模型组，以MTT法观察加味四逆散含药血清对皮质酮、谷氨酸所致PC12细胞损伤的保护作用，结果显示200μmol／Lcort、50μmol／LGlu组细胞存活率分别为51.67％和46.77％，与正常细胞对照组相比显著降低（p＜0.05-0.001），表明皮质酮和谷氨酸损伤PC12细胞模型建立。Cort+5％JWSNS含药血清低、中、高剂量组细胞存活率分别为46.77％、52.62％、48.38％，Glu+5％JWSNS含药血清低、中、高剂量组细胞存活率分别为45.19％、48.26％、46.77％，Cort、Glu+5％正常血清组细胞存活率分别为45.16％、43.55％，Cort、Glu+10％正常血清组细胞存活率分别为56.29％、50.23％，Cort、Glu+5％JWSNS含药血清组及Cort、Glu+5％、10％正常血清组细胞存活率与模型组相比均无显著差异（P＞0.05），表明5％JwSNS含药血清组及正常血清均无明显抗损伤作用。Cort+10％JwSNS含药血清低、中、高剂量组细胞存活率分别为72.58％、87.11％、75.81％，Glu+10％JWSNS含药血清低、中、高剂量组细胞存活率分别为69.35％、82.25％、70.97％，与皮质酮、谷氨酸模型组及正常血清组相比，细胞存活率均明显升高，差异有显著性（P＜0.05-0.01），表明10％加味四逆散血清对谷氨酸、皮质酮所致PC12细胞的损伤具有保护作用。第二部分加味四逆散含药血清对皮质酮、谷氨酸诱导PC12细胞凋亡的保护作用及对BDNF蛋白表达的影响细胞凋亡（apoptosis）是多细胞有机体在一定的生理条件下，通过内源性DNA内切酶的激活，主动结束生命的过程。慢性应激可以通过多种方式和途径引起神经元细胞凋亡而参与应激所致的脑损害。脑源性神经营养因子（BDNF）在中枢神经系统发育过程中起重要作用，对多种神经元有促进生存、有助分化和再生、增进代谢、增强功能表达及营养、支持、保护的作用。其表达水平下降可引起抑郁症的某些病理生理过程。本实验用形态法、Annexin V／PI双标流式细胞术观察加味四逆散含药血清对皮质酮、谷氨酸诱导PC12细胞凋亡的影响。实验分为正常细胞对照组、200μmol／LCort、50μmol／L Glu损伤模型组、200μmol／LCort、50μmol／L Glu损伤+10％JWSNS含药血清组、200μmol／L Cort、50μmol／L Glu损伤+10％正常血清组。用吖啶橙（AO）和Hoechst33342 （Ho）荧光染色观察皮质酮、谷氨酸致PC12细胞凋亡的形态学变化；在荧光显微镜下可见AO染色后活细胞的细胞核呈亮绿色，死亡细胞的细胞核呈暗绿色，胞质整个呈暗绿色。Hoechst 33342染色后细胞核呈蓝色，活细胞的蓝色荧光最强，而早期凋亡细胞蓝色荧光较弱。以细胞萎缩、核固缩、染色质凝聚、凋亡小体形成和荧光强度增强等作为凋亡细胞指征，与正常组细胞相比，皮质酮和谷氨酸组细胞生长状态较差，多见核染色质浓缩密集，边缘化，形成深染团块呈新月状或戒指状，位于核膜下，核破裂出芽形成凋亡小体等细胞凋亡的形态学表现及死亡细胞；含药血清组细胞生长状态较好，少见凋亡和死亡细胞形态。采用Annexin V／PI双标流式细胞术检测PC12细胞凋亡率，可见正常细胞组细胞凋亡率为（16.24±0.78）％，200μmol／LCort、50μmol／L Glu损伤模型组细胞凋亡率分别为（45.91±0.95）％，（39.58±0.7）％，与正常细胞对照组相比明显升高（p＜0.001），表明皮质酮、谷氨酸可以诱导PC12细胞发生早期凋亡。200μmol／LCort、50μmol／L Glu损伤+10％JWSNS含药血清组细胞凋亡率均下降，其中中剂量组细胞凋亡率分别为（28.99±1.20）％、（23.89±0.35）％，高剂量组细胞凋亡率分别为（31.82±2.04）％、（29.84±0.97）％，与200μmol／LCort、50μmol／L Glu损伤模型组比较差异有显著性（P＜0.05-0.01），200μmol／LCort、50μmol／L Glu损伤+10％JWSNS含药血清组中、高剂量组细胞凋亡率明显低于200μmol／LCort、50μmol／LGlu损伤+10％正常血清组（P＜0.05-0.01），表明加味四逆散含药血清具有减少皮质酮、谷氨酸诱导PC12细胞凋亡的作用。200μmol／LCort、50μmol／L Glu损伤+10％正常血清组细胞凋亡率与200μmol／LCort、50μmol／L Glu损伤模型组比较无显著差异，表明正常大鼠血清无抗皮质酮、谷氨酸诱导PC12细胞凋亡的作用。用间接免疫荧光染色法观察JWSNS含药血清对皮质酮、谷氨酸诱导PC12细胞凋亡时BDNF蛋白表达的影响。皮质酮、谷氨酸致损伤PC12细胞内BDNF的表达见：FITC标记的BDNF阳性免疫荧光染色产物为绿色。在阴性对照组样本未观察到BDNF免疫荧光阳性反应物。正常细胞对照组BDNF有少量表达；损伤模型组与正常细胞对照组相比，BDNF阳性表达很少，主要呈细小的颗粒状且荧光强度很低，几乎与背景色相同，表明皮质酮、谷氨酸抑制了PC12细胞BDNF的表达。加味四逆散含药血清组BDNF的阳性表达增多（++-+++），荧光强度明显增强，显著高于损伤模型组（±）及损伤+正常血清组（+），绿色荧光颗粒呈点状或带状分布于细胞核周围，其中200μmol／LCort、50μmol／L Glu损伤+10％JWSNS含药血清中剂量组BDNF的阳性表达最多，荧光强度最高（+++），与损伤模型组和200μmol／LCort、50μmol／LGlu损伤+正常血清组比较有明显差异，说明加味四逆散含药血清可提高皮质酮、谷氨酸诱导凋亡的PC12细胞内BDNF的表达。第三部分加味四逆散含药血清对皮质酮、谷氨酸致PC12细胞胞内[Ca²⁺]i的影响Ca²⁺是细胞内重要的信使分子之一，胞内游离钙离子浓度的变化是调节细胞生理功能的重要物质基础，细胞内钙离子的浓度异常，可通过信号转导途径，引起组织损伤。本研究采用激光共聚焦显微镜观察加味四逆散含药血清对皮质酮、谷氨酸致PC12细胞内[Ca²⁺]i的影响。实验分为正常细胞组、200μmol／LCort、50μmol／L Glu损伤模型组、200μmol／LCort、50μmol／L Glu损伤+含药血清组，200μmol／LCort、50μmol／L Glu损伤+正常血清组。以Fluo-3／AM（5μmol／L）探针装载液，在激光显微镜下取不同视野选择神经细胞进行扫描。结果表明正常PC12细胞普遍为低荧光强度细胞，细胞内钙离子浓度为53.6±7.9；200μmol／LCort、50μmol／L Glu损伤模型组PC12细胞内钙荧光强度明显增强，分别达到134.9±12.1、162.3±5.3，胞内钙离子浓度明显升高（P＜0.001）；与皮质酮、谷氨酸组相比，200μmol／LCort、50μmol／LGlu损伤+含药血清组细胞荧光强度均明显减弱，并且弱于正常血清组，其中中剂量组细胞荧光强度值分别为64.7±4.8、69.7±6.7，与皮质酮、谷氨酸和正常大鼠血清组相比有显著性差异（P＜0.01-0.001）。表明皮质酮、谷氨酸可致PC12细胞内钙离子浓度升高，使PC12细胞内发生钙超载；调肝方药加味四逆散含药血清具有缓解皮质酮、谷氨酸所致PC12细胞胞内钙超载的效应。第四部分加味四逆散含药血清对转录因子cAMP反应元件结合蛋白（CREB）及其磷酸化（P-CREB）的影响cAMP反应元件结合蛋白（CREB）是位于细胞核内的转录因子，作为核内第三信使之一，在神经系统应激性损伤后提供了神经保护信号。多种应激刺激通过细胞内信号转导途径使CREB第133位的丝氨酸磷酸化而激活，活化的CREB直接或间接激活相关基因的转录，进而表述某些蛋白分子以及某些神经营养因子等，进而调节神经元在应激性损伤后再生、存活及修复等。本研究采用免疫组织化学方法、Western blot法分别检测加味四逆散含药血清对CREB及其磷酸化（P-CREB）的影响。免疫组化法检测CREB的表达，实验分为正常细胞组、200μmol／LCort、50μmol／LGlu损伤模型组、200μmol／LCort、50μmol／L Glu损伤+10％JWSNS含药血清组，200μmol／LCort、50μmol／L Glu损伤+10％正常血清组。正常PC12细胞CREB阳性细胞主要为定位于细胞核，呈棕黄色着色。CREB表达量为30.27±6.2；200μmol／LCort、50μmol／L Glu损伤模型组细胞核中检出CREB呈现浅棕色，表达量分别为17.1±8.2、20.8±5.7，与正常细胞组相比，CREB表达明显降低（P＜0.01）；正常血清组CREB表达量升高至25.7±6.5、26.3±8.2，与200μmol／LCort、50μmol／LGlu损伤模型组相比，无统计学意义。加味四逆散含药血清组可见核染色加深，呈深棕色，CREB表达量明显增多，其中中剂量组增高到62.6±11.7、79.5±7.6，与200μmol／LCort、50μmol／L Glu损伤模型组和正常血清组比较均有显著性差异（P＜0.01-0.001）；表明皮质酮、谷氨酸可下调PC12细胞内CREB的表达，加味四逆散含药血清能上调CREB的表达，并且以中剂量组增加最明显，而正常大鼠血清则无此作用。Western blot法检测磷酸化CREB（Ser133）的表达：实验分正常细胞组、200μmol／LCort、50μmol／LGlu损伤模型组、200μmol／LCort、50μmol／L Glu损伤+10％JWSNS含药血清组和200μmol／LCort、50μmol／L Glu损伤+10％正常血清组。p-CREB在不同组别中的表达量存在差异，与正常细胞组相比，200μmol／LCort、50μmol／LGlu损伤模型组P-CREB的表达量降低，JWSNS含药血清组p-CREB蛋白表达量明显增多，与Cort、Glu损伤模型组相比差异有显著性（P＜0.01），与正常血清组相比有差异（P＜0.05）。本研究采用了细胞和分子生物学方法探讨了调肝方药加味四逆散对细胞损伤模型PC12细胞的保护效应，以证实肝主疏泄调畅情志功能的神经生物学分子机制，研究结果提示，加味四逆散含药血清对谷氨酸、皮质酮所致PC12细胞损伤具有显著保护作用，可提高皮质酮、谷氨酸诱导凋亡的PC12细胞BDNF的表达，具有缓解皮质酮、谷氨酸所致PC12细胞胞内钙超载的效应，以中剂量组效应最强。加味四逆散含药血清能上调CREB的磷酸化水平，上调CREB的表达。综上所述，本研究就上述问题进行了一系列理论和实验研究，其中重点对肝主疏泄调畅情志功能的细胞和分子机制进行了初步的研究。目前，心理应激以一种融合生物-心理-社会模式的概念在生物医学领域中得到了广泛的应用。由于机体的心理应激机制与诸多疾病的发生发展和转归有着密切的关系，中医肝调节情志变化的中枢神经生物学物质基础及作用方式仍需深入探索。