论文部分内容阅读
维吉尼亚链霉菌IBL-14是本实验室从甾体制药厂污泥中分离得到的一株能够转化和降解甾醇类化合物(如孕酮、皮质醇等)的微生物。本研究发现其在以胆固醇作为唯一碳源的培养基中能生长,说明维吉尼亚链霉菌IBL-14能对胆固醇进行降解作用。胆固醇降解的第一步是在胆固醇氧化酶催化下完成的,中间参与的辅酶是黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD),整个反应分为氧化反应和异构反应,先催化胆固醇C3位羟基氧化成羰基,生成中间产物五烯三酮,同时生成次级代谢产物过氧化氢(H202),然后催化C5位烯烃双键异构成C4位烯烃双键,生成最终产物4-胆甾烯-3-酮。本课题研究1BL-14对胆固醇的生物转化作用。研究先利用SWISSPROT. TREMBL、KEGG数据库对IBL14全基因组测序结果进行功能注释,通过在基因组注释中以胆固醇为条件筛选到4个可能的胆固醇氧化酶基因,分别命名为cho-sv01、cho-sv02、cho-sv03和cho-sv04。ExPASy在线软件分析表明：四种胆固醇氧化酶(Cho-sv01、Cho-sv02、Cho-sv03和Cho-sv04)的氨基酸序列中氨基酸的摩尔比差距很小,蛋白的等电点(除Cho-sv03外)均大于8.0,分子量大约50～65kD。用软件MEGA5.0中的nighbor-joining (NJ)方法分析得到胆固醇氧化酶与链霉菌属中的其他菌株同源性达到85%～96%之间,进而推测四种蛋白属于GMC家族。进化树构建结果显示Cho-sv04与来源Streptomyces sp.SA-COO的胆固醇氧化酶亲缘关系最近,功能可能具有相似性。对维吉尼亚链霉菌IBL-14中的四个胆固醇氧化酶基因进行了克隆表达,得到E.coli BL21(DE3)/pHT304-cho-sv01, E.coli BL21(DE3)/pHT304-cho-sv02, E.coli BL21(DE3)/pHT304-cho-sv03 and E.coli BL21(DE3)/pHT304-cho-sv04四个突变菌株。通过低温蛋白诱导和SDS-PAGE电泳检测,四种胆固醇氧化酶都得到表达,且大部分分布在破碎上清中,这为后期的蛋白纯化和功能鉴定打下了基础。对胆固醇氧化酶(Cho-sv04)的纯化和功能进行了初步的研究。经过(NH4)2SO4盐析、超滤及CM Sepharose FF阳离子交换层析,得到初步纯化蛋白,终比酶活达到1.10 U/mg。以胆固醇作为底物,通过HPLC方法对Cho-sv04转化产物进行定性分析,发现发酵反应液中生成的产物与标准品4-胆甾烯-3-酮的出峰时间一致,推测产物是4-胆甾烯-3-酮,表明Cho-sv04蛋白具有转化胆固醇的功能。对胆固醇氧化酶(Cho-sv04)的蛋白结构和作用机理进行了研究。Clustalx和Discovery studio 2.5软件分析发现：Cho-sv04与来源于Streptomyces sp.SA-COO的ChoA蛋白的二级结构和三级结构具有极大的相似性。利用同源建模方法以1N4W和1COY为模板构建Cho-sv04的三维结构模型。ChoA蛋白与Cho-sv04的氨基酸序列上均有FAD结合保守序列；空间结构中具备一个口袋结构的活性位点,活性位点的关键氨基酸残基为Phe82、Leu372、Leu435、Asn324、Clu364、 His450和Asn488,且两蛋白的关键氨基酸残基位置基本一样,推测可能具备相同功能。已证明ChoA蛋白中His在类固醇降解过程中为类固醇羟基氧原子的氢键供体。为进一步研究蛋白Cho-sv04的作用机理,将在Cho-sv04蛋白中的His450点突变为Leu450,发现E. coli BL21 (DE3)/pHT304-cho-sv04L450突变菌株失去了转化胆固醇的能力,表明His450在Cho-sv04蛋白功能中起着重要作用。