目前,心血管疾病已成为人类健康的最大威胁之一,关于血栓病的治疗和新型溶血栓类药物的开发与应用的研究成为近几年热点。纳豆激酶作为功能性食品和食品添加剂等的发展已十分迅速,其降血压、降血脂、抗血栓、抗病毒、抗氧化、预防癌症等多种生理调节功能使其为新一代具有开发潜力的食源性溶栓药物。但由于纳豆激酶主要来源于日本纳豆,因口味独特而不被大众接受,所以在食品方面开发较少,因此,将纳豆激酶作为功能性食品开发迫在眉睫。而乳酸菌作为安全的食品级微生物已逐渐成为当今世界食品业发展的必然趋势。伴随着分子生物学和生物技术的快速发展,研究者对其研究并不仅限于对其传统生理功能的开发,而逐步深入到乳酸菌基因水平的研究。人们利用DNA重组技术,成功构建适用于乳酸菌的表达载体,使乳酸菌能够成功表达外源基因,从而具备新的益生性能。本文通过将载体p MGthy A-pp NK电转保加利亚乳杆菌thy A缺陷型菌株,实现纳豆激酶在乳酸菌中食品级表达。通过测定质粒稳定性,证明该载体在保加利亚乳杆菌中连续传代15代仍可以稳定存在,结合平板划线进行传代时可连续传代30代稳定。利用半定量RT-PCR的方法,从基因水平验证了保加利亚乳杆菌异源表达纳豆激酶。由SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶分析纳豆激酶的分子量约为28 KD。通过测定保加利亚乳杆菌异源表达食品级纳豆激酶的酶学性质,证明纳豆激酶的最适温度为40℃,在低于40℃时热稳定性较好,最适p H为7.0,p H在6.0-8.0范围内较稳定。Ca²⁺、Mn²⁺、Fe²⁺促进酶活的活性随着浓度的变化而不同,Cu²⁺、Hg²⁺对该酶起到明显的抑制作用,Ag+随浓度的增加抑制效果逐渐显著,而蛋白抑制剂PSMF对纳豆激酶具有明显抑制作用,说明纳豆激酶为丝氨酸蛋白酶。根据单因素实验结果设计正交实验对培养条件进行优化,确定了适宜培养条件为培养时间18 h,接种量2%,接种龄为16h,酶活达到3.498 U/m L,是未优化前酶活的1.16倍。由于本实验证明纳豆激酶在模拟人工胃液中几乎没有酶活,胃蛋白酶对纳豆激酶的影响是不可逆的,但纳豆激酶可以在肠液中稳定存在而并不被胰蛋白酶所降解,在肠液4 h时相对酶活可达到60%左右。因此,本研究将纳豆激酶转化至保加利亚乳杆菌中,利用乳酸菌携带纳豆激酶顺利通过胃液到达肠道,结果证明该酶到达肠道保留了一定酶活,并在肠道达到3 h时酶活到达最高,由于菌体的解体,胞外酶活为32%左右。微量金属离子可以促进菌体自溶从而提高纳豆激酶的释放,实验证明Ca²⁺和Mg²⁺在浓度为10^-4 mol/L时,自溶度最大分别达到25%和24%左右,相对酶活达到129%和123%左右;Mn²⁺在浓度为10-5 mol/L时自溶度最大,可到达20%左右,相对酶活达到114%左右,和空白对照相比较均有所提高。并且通过体外溶栓实验证明保加利亚乳杆菌异源表达食品级纳豆激酶具有明显的溶栓活性,并利用灭活纤溶酶原的方法表明该酶溶解纤维蛋白的作用不同于尿激酶的间接纤溶作用,而是直接作用于纤维蛋白。本实验结果为食品级表达载体在乳酸菌中异源表达提供了可参考的依据,同时为乳酸菌食品级表达纳豆激酶在应用方面提供技术储备,并为新型功能性乳制品的开发奠定理论基础。