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慢性乙型肝炎(Chronic hepatitis B,CHB)是世界范围内的重要公共卫生问题,中医药对CHB的防治已显示其独特优势,进一步提高中医药防治能力,深入阐述CHB的证候生物学基础,似为其主要一环。四川地区CHB常见的中医证候为脾胃湿热证与肝郁脾虚证,课题组前期从mi RNA对上述两证候的生物学基础进行了初步研究。有文献表明DNA甲基化参与CHB的发生发展,且DNA甲基化与中医证候的形成在理论上似有契合之处,此或许能为CHB脾胃湿热证与肝郁脾虚证生物学基础的研究提供新的思路。目的:本研究基于前期相关mi RNA研究,多维度综合观察CHB脾胃湿热证与肝郁脾虚证DNA甲基化水平的差异表达,探讨上述两证候的生物学基础是否是通过DNA甲基化与mi RNA相互调控,影响表观遗传,进而调节基因表达,形成不同的证候,以期初步证实DNA甲基化的差异表达是否为CHB证候差异的主要表观遗传机制之一,为上述两种CHB中医证候的客观化与规范化提供部分实证依据。方法:1.招募CHB脾胃湿热证(Spleen-stomach damp heat syndrome,SSDHS)患者7例SSDHS组),肝郁脾虚证(Liver depression and spleen deficiency syndrome,LDSDS)患者7例(LDSDS组)和健康志愿者6例(健康对照组(Healthy control,HC))。2.采集所有受试者清晨空腹、无菌环境下外周静脉血,检测各组间肝功能相关指标、乙肝两对半定性及HBV-DNA含量。3.用ELISA法检测各组间DNA甲基化相关蛋白DNMT1、Me CP2的表达水平及HBV相关蛋白P53、E-cad、P16的表达水平。4.及时分离外周静脉血血清,提取DNA,用Illumina Bead Array TM Infinium850K甲基化芯片检测各组间DNA甲基化差异表达的情况,对差异甲基化位点相关基因进行GO功能富集和KEGG pathway富集分析。5.利用Target Scan7.2与miRDB数据库对不同中医证候中部分相同mi RNAs靶基因进行预测,采用Cytoscape3.6软件构建DNA甲基化基因与mi RNAs预测靶基因共表达网络图。结果:1.SSDHS、LDSDS组分别与HC组相比,在DNMT1、p16表达水平、性别、年龄、病程、生化指标、乙肝两对半定性及HBV-DNA含量检测结果方面均无显著性差异(P>0.05);E-cad表达水平均有显著性差异(P<0.05),Me CP2、P53表达水平在SSDHS组中无显著性差异(P>0.05),在LDSDS组中有显著性差异(P<0.05)。2.Illumina Bead Array TM Infinium 850K甲基化芯片检测结果显示CHB患者组与HC组有7868个显著差异甲基化位点,其中高甲基化位点2310个,低甲基化位点5558个;经过筛选高甲基化差异程度最高的位点为cg03278611位于基因NLGN4Y,低甲基化差异程度最高的位点为cg03670113位于基因TAZ;差异甲基化位点相关基因GO功能主要富集在蛋白质去泛素化、I-kappa B激酶/NF-kappa B信号、脂肪颗粒、各种酶等;KEGG pathway主要富集在类固醇生物合成通路、PPAR信号通路等。3.SSDHS组特有的高甲基化差异程度最高的位点为cg21898358位于基因LILRA3,低甲基化差异程度最高的位点为cg09323788位于基因CHTF18,差异甲基化位点相关基因GO功能主要富集在T细胞共刺激、Rho蛋白信号转导、Rho GTPases相关的功能等;KEGG pathway主要富集在ABC转运蛋白、AMPK信号通路及肿瘤相关通路;LDSDS组特有的高甲基化差异程度最高的位点为cg09857096位于基因BMPR1B,低甲基化差异程度最高的位点为cg09972436位于基因LCE3C,差异甲基化位点相关基因GO功能主要富集在树突棘、丝氨酸/苏氨酸激酶、Rac GTPase等;KEGG pathway主要富集在苯丙氨酸代谢、氮代谢、丙氨酸、天门冬氨酸和谷氨酸代谢等代谢通路;SSDHS组与LDSDS组间最显著的高甲基化位点为cg10765459位于基因COL6A2,最显著的低甲基化位点为cg07445365位于基因STK32C,差异甲基化位点相关基因GO功能主要富集在肌动蛋白相关细胞及组织,KEGG pathway主要富集在Erb B信号通路及代谢通路等。4.SSDHS、LDSDS组差异甲基化位点相关基因分别与mi R-122-5p、mi R-1228-3p、mi R-191-3p预测靶基因进行对比分析:两证候差异甲基化位点相关基因与mi R-122-5p预测靶基因均有6个基因重合,其中SSDHS组独有基因为RIMS1,LDSDS组独有基因为SLC41A1;SSDHS组差异甲基化位点相关基因与mi R-1228-3p预测靶基因有21个基因重合,该组独有基因为OTUB、AMPH、SEMA3C、ZC3H12B、PCGF3、JAKMIP3,LDSDS组差异甲基化位点相关基因与mi R-1228-3p预测靶基因有17个基因重合,该组独有基因为ARID1B、NUDT7;SSDHS组差异甲基化位点相关基因与mi R-191-3p预测靶基因有2个基因重合,该组独有基因为MPP7、LDSDS组差异甲基化基因与mi R-191-3p预测靶基因有3个基因重合,该组独有基因为SPTB2、CCNY。结论:1.Me CP2、P53可能通过影响DNA甲基化修饰参与CHB肝郁脾虚证的形成;E-cad可能是CHB脾胃湿热证或肝郁脾虚证形成的物质基础之一。2.CHB患者存在DNA甲基化的差异表达,具体机制可能与NLGN4Y、TAZ等基因的甲基化及蛋白质去泛素化、I-kappa B激酶/NF-kappa B信号、类固醇生物合成通路、PPAR信号通路等有关。3.CHB脾胃湿热证与肝郁脾虚证均存在DNA甲基化的差异表达,同时分别具有各自特有的DNA甲基化谱。LILRA3、CHTF18等基因的甲基化及T细胞共刺激诱导肝脏炎症等,可能是CHB脾胃湿热证的分子生物学基础;BMPR1B、LCE3C等基因的甲基化及树突棘的改变和物质代谢异常等,可能是CHB肝郁脾虚证的分子生物学基础,提示DNA甲基化可能为CHB脾胃湿热证与肝郁脾虚证差异的表观遗传机制之一。4.不同证候出现部分相同mi RNA的原因可能与其影响不同靶基因甲基化水平的差异性有关,具体调控机制尚需进一步研究证实。