研究目的帕金森病(Parkinson’sdisease,PD)是一种常见的神经退行性疾病,患病率高且逐年上升。PD确切发病机制未明,与PD相关的环境因素中,农药暴露受到广泛关注,其中百草枯(paraquat,PQ)和代森锰(maneb,MB)均被证明与PD发生有关。PQ作为除草剂广泛用于农业生产中。近年来的流行病学资料提-示,来自职业、饮水及食物等途径慢性低剂量PQ暴露能够增加PD、阿尔兹海默病(Alzheimer’sdisease,AD)等慢性神经退行性疾病的发病风险。PQ可以透过血脑屏障进入脑内,产生大量超氧自由基,损伤内源性抗氧化功能,呈现神经毒性作用。MB是常用于农业消毒的杀真菌剂。MB中锰元素和除锰之外的母体化合物均有神经毒性作用,且与PD发生相关。MB可以引起线粒体功能失衡,导致细胞氧化损伤诱发神经毒性。目前,PQ和MB二者联合慢性染毒已成为构建PD动物模型的公认方法,但PQ与MB联合的神经毒性机制尚不完全清楚,也缺乏预防和治疗中毒的特效药物。流行病学调查和实验研究均发现PQ和MB能引起脑内异常。长期低剂量接触包括PQ、MB在内的多种农药能升高PD患病率。实验观察到PQ与MB导致大脑氧化应激,NF-κB磷酸化水平升高,小胶质细胞激活。已知小胶质细胞的活化分为具有促炎作用的M1型极化和抗炎作用的M2型极化。尤其近年来发现一种新的细胞程序性死亡方式——细胞焦亡(pyroptosis),在CNS疾病中起到重要作用。相比于细胞凋亡(apoptosis),细胞焦亡发生的更快,是一种依赖半胱氨酸蛋白酶-1(cysteinyl aspartate specific proteinase,caspase-1)的炎性死亡,主要伴随大量促炎症因子白细胞介素1β(interleukin,IL-1β)的释放。PQ与MB联合作用引起的中枢损伤是否与小胶质细胞M1/M2型极化失衡相关,是否存在神经元焦亡,目前尚未见报道。因此在本实验研究中,我们观察了染毒小鼠大脑小胶质细胞的激活和神经元焦亡情况,检测了 M1型和M2型极化标志性分子变化趋势,观察了中脑及脑桥-延髓内NLRP3和caspase-1表达,以及NF-κB激活情况和ROS含量变化。进一步观察了格列本脲(glibenclamide,Gli)对PQ与MB联合毒性的预防和逆转作用,通过检测小鼠神经行为学表现,中脑及脑桥-延髓中上述指标是否发生改变,评价Gli对联合毒性的预防效果,进一步探讨NLRP3炎性小体介导的神经元焦亡在PQ与MB联合慢性毒性诱导PD样症状中的作用。研究方法1.实验动物分组和处理:(1)预防实验:100只C57BL/6雄性8周龄SPF级小鼠,体重18～20 g,适应性喂养5天,随机分为对照组、PQ+MB染毒组、PQ+MB+Gli干预组、Gli对照组,每组25只。动物染毒前腹腔注射Gli,剂量为10mg/kg.bw,30 min后,PQ与MB分别按照10mg/kg.bw、30mg/kg.bw经腹腔注射染毒,2次/周,连续8周。染毒结束,部分小鼠取脑组织用于病理切片观察,部分小鼠经眼球放血处死后剥离中脑、脑桥-延髓等部位。(2)治疗实验:92只SPF级C57BL/6雄性8周龄小鼠(18～20g),适应性喂养5天后,按体重随机分为对照组、PQ+MB染毒组,每组46只。PQ与MB分别按照10mg/kg.bw、30mg/kg.bw经腹腔注射染毒,对照组给予等体积溶剂,2次/周,连续8周,建立PD样CNS损伤的动物模型。自第10周起PQ+MB染毒组动物平均分为Gli治疗组和溶剂对照组,Gli剂量10 mg/kg.bw,经腹腔注射给予,2次/周,连续5周。另一组给予等体积的溶剂。对照组也相应分为Gli对照组和空白对照组,Gli和溶剂给予同上。实验结束次日晨处死动物,部分小鼠取脑组织用于病理切片观察,部分小鼠经眼球放血处死后剥离中脑、脑桥-延髓等部位进行检测。2.转棒疲劳测试:分别于实验第2、4、6、8、12、14周末进行转棒实验,小鼠由转棒上脱落时仪器自动记录潜伏期。每组测试10只小鼠。3.粪便收集实验:分别于实验第2、4、6、8、12、14周末收集动物粪便。收集时间为60 min,记录排便粒数,根据粪便湿重和干重,计算粪便含水量。4.免疫组化检测:制备各组动物脑的冰冻切片,采用免疫组化法观察中脑小胶质细胞形态。5.qPCR检测:检测各组小鼠脑内小胶质细胞M1/M2极化的关键分子IL-1β、iNOS、TNF-α、Arginase-1、YM-1、CD206mRNA 表达,以及 NLRP3 炎性小体中NLRP3、caspase-1mRNA表达量的变化。6.Western blot检测:检测小鼠中脑和脑桥-延髓中iNOS、Arginase-1、Iba-1、NLRP3、IL-1β、caspase-1p10、NF-κB、磷酸化NF-κB 的相对蛋白表达量。7.荧光染料法ROS检测:采用荧光染料,检测小鼠脑内ROS的含量。结果1.PQ与MB联合作用及Gli对大鼠体重影响:与对照组相比,PQ+MB染毒组、Gli预防与治疗组体重均无统计学差异(P>0.05)。2.PQ与MB联合作用及Gli对小鼠神经行为学影响:(1)预防实验:转棒疲劳测试中,与对照组相比,PQ+MB染毒组小鼠转棒潜伏期明显减少(P<0.01),Gli预防可明显改善染毒小鼠运动协调能力,Gli预防组潜伏期明显高于染毒组(P<0.05)。粪便收集实验中,PQ+MB染毒组粪便含水量和排便粒数明显低于对照组(P<0.05),Gli作为预防药物有效的增加了排便粒数(P<0.05),粪便含水量较染毒组有上升趋势。提示Gli可以预防PQ+MB导致的便秘症状。(2)治疗实验:转棒疲劳测试中,PQ+MB染毒组小鼠转棒潜伏期从第4周起有下降趋势,第8周时明显低于对照组(P<0.01)。自第8周给予Gli治疗,至第14周末时,PQ+MB染毒动物的转棒潜伏期与对照动物均有明显统计学差异(P<0.01)。粪便收集实验中,自第2周起,PQ+MB染毒组小鼠粪便含水量和排便粒数较对照组明显降低(P<0.01),给予Gli治疗能够改善染毒动物的便秘情况,第12周时,Gli治疗组动物粪便含水量和排便粒数高于染毒组(P<0.01)。3.PQ与MB联合作用对小鼠脑内小胶质细胞形态学影响:PQ+MB染毒小鼠小胶质细胞胞体明显增大,呈圆形,伪足明显,呈现“阿米巴样”变化,提示小胶质细胞被激活,Gli预防和治疗后活化均明显减弱。4.PQ与MB联合作用对小鼠脑内小胶质细胞极化的影响:动物给予PQ与MB联合染毒,小鼠脑内Iba-1、iNOS较对照组明显升高(P<0.05),染毒组中脑、脑桥-延髓内TNF-αmRNA表达明显增高(P<0.01)。提示PQ+MB染毒可导致小鼠脑内小胶质细胞M1极化。PQ+MB染毒组小鼠中脑Arginase-1 mRNA表达量也较对照组明显增高(P<0.05,P<0.01),脑桥-延髓中CD206mRNA表达高于对照组(P<0.01),提示染毒可引起部分小胶质细胞M2极化。染毒同时给予Gli预防可明显抑制小胶质细胞活化,Gli预防组脑桥-延髓中Iba-1表达量低于染毒组(P<0.01)。Gli预防组中脑、脑桥-延髓中TNF-α mRNA和iNOS蛋白表达均较PQ+MB 染毒组明显降低(P<0.01),但对 Arginase-1、YM-1、CD206 mRNA 表达影响不大。5.PQ与MB联合作用对小鼠脑内NLRP3炎性小体激活及神经元焦亡的影响:与对照组相比,PQ+MB组脑内NLRP3、IL-1β、caspase-1 mRNA表达量有升高趋势,IL-1β、caspase-1 mRNA表达量有统计学差异(P<0.01,P<0.05),PQ+MB染毒组NLRP3、成熟IL-1p、caspase-1p10蛋白水平均高于对照组(P<0.05)。与PQ+MB组相比,Gli预防组脑内NLRP3、IL-1β、caspase-1mRNA表达有降低趋势(P>0.05),但三者蛋白表达水平较PQ+MB组明显降低(P<0.01,P<0.05)。给予Gli治疗后,NLRP3、IL-1β、caspase-1mRNA表达有较PQ+MB组降低趋势,蛋白表达也较染毒组显著降低(P<0.05)。6.PQ与MB联合作用对小鼠脑内NF-κB激活的影响:与对照组相比,PQ+MB染毒组NF-κB和磷酸化NF-κB蛋白表达均明显增高(P<0.05,P<0.01).Gli预防组中脑NF-κB和磷酸化NF-κB较PQ+MB组有降低趋势,Gli可以显著降低脑桥-延髓部位磷酸化NF-κB含量(P<0.01)。Gli治疗可以有效降低NF-κB和磷酸化NF-κB蛋白水平(P<0.05)。7.PQ与MB联合作用对小鼠脑内ROS含量的影响:PQ+MB组小鼠脑内ROS含量较对照组升高(P<0.05),提示PQ与MB染毒可能导致了小鼠脑内氧化应激和炎症反应发生,Gli预防组和治疗组小鼠脑内ROS均明显少于染毒组(P<0.01,P<0.05)。结论1.PQ与MB联合染毒可导致实验动物出现PD样症状,动物脑内神经细胞焦亡。2.PQ与MB联合慢性毒性可使脑内小胶质细胞M1型极化、M1/M2极化失衡,导致神经炎症反应。3.K+通道抑制剂格列本脲能有效预防PQ与MB诱导的动物脑内炎症反应和神经元焦亡。