肠道病毒71型(Enterovirus71, EV71)为小RNA病毒科肠道病毒属成员,是目前肠道病毒群中最晚发现的病毒,其感染性强且致病率高,是引起手足口病(hand-foot-mouth disease, HFMD)的主要病原体。由于肠道病毒EV71对中枢神经系统有极高的感染性,其并发症包括无菌性脑膜炎(aseptic meningitis)、脊髓灰质炎样麻痹(poliomyelitis-like paralysis)、急性无力肢体麻痹(acute flaccid paralysis)、神经源性肺水肿(neutrogena pulmonary edema, NPE)等,重症患者比例、致残率及致死率均明显高于其他肠道病毒。而感染肠道病毒EV71患者,多为无临床症状或出现轻微类似感冒的症状,常被患者忽视而转成重症患者,其危害性不容小觑。肠道病毒EV71感染疾病是全球性传染病,在世界范围内已引起10余次大规模的暴发与流行。目前对其重症感染尚无有效的预防疫苗及治疗手段,研究相关早期诊断的试剂对于手足口病的防治具有重要的临床意义。目前常用的实验室诊断方法包括免疫学方法、病毒分离培养、PCR方法等,但都分别存在难以早期诊断、敏感度低的缺陷。由于人体对于外来病原体的免疫产生有一定的滞后,使得免疫学的检测方法不能在患者患病早期得出相应的结果,敏感性相对较低,延误病情。病毒分离的方法虽然准确,其方法复杂,操作繁琐,容易延误最佳时机。PCR方法虽不存在这个问题,但易出现假阳性结果。因此,都不能实现有效确诊的早期诊断。基因芯片与荧光定量PCR技术的方法,在核酸的水平上进行检测,对人体内所具有的相应核酸可达到早期检测的目的,为肠道病毒EV71的早期诊断,提供了快速、高效、敏感、自动化的方法。本课题首先构建了肠道病毒EV71的cDNA亚克隆,为进一步后续建立肠道病毒EV71早期检测方法提供实验基础。其次,建立了荧光定量PCR检测方法,并对其特异性、重复性和灵敏性进行了分析验证。再次,筛选设计出肠道病毒EV71的检测探针,以构建的亚克隆作为标准品,构建肠道病毒71型寡核苷酸芯片,为今后多病毒的联合检测芯片的制备打下基础。本课题第一部分对肠道病毒EV71中的VP4、VP2、VP3、VP1基因进行了长片段的RT-PCR扩增,构建了cDNA亚克隆。由于肠道病毒EV71属于RNA病毒,从临床样品中获取的肠道病毒EV71基因组的量非常少,因此在逆转录过程中,对其进行了优化。第一,使用二步法的反转录流程,将引物和RNA在65℃变性15min,消除可能存在的聚合物和二聚体；37℃逆转录1h,温度升高到85℃10min,消除RNA-cDNA杂交体。第二,针对RNA模板存在的二级结构及PolyA尾结构,在逆转录过程中,只加入随机引物进行延伸,随机引物适用于rRNA、mRNA、tRNA等所有RNA的逆转录反应。虽然该过程使特异性会略微下降,但效果较为稳定,得到cDNA产物较多。成功构建的亚克隆区间包括肠道病毒EV71序列的577bp-3581bp。包括病毒的结构蛋白VP4序列、结构蛋白VP3序列、结构蛋白VP2序列、结构蛋白VP1序列。该亚克隆的构建,不仅为后续临床检测方法的建立,提供了有效的阳性质粒；也为研究肠道病毒分型、感染、复制及基因工程疫苗的研制提供材料。荧光定量PCR是在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。检测根据所使用的标记物不同可分为荧光探针和荧光染料。SYBR-Green染料法是荧光染料方法的典型代表。SYBR-Green是一种双链DNA集合染料,能与DNA双链的小沟特异性结合,PCR反应中高温变性时,DNA双链分开,无荧光,而PCR反应中低温复性和延伸时,形成双链DNA,SYBR-Green发荧光,此阶段采集信号。由于PCR扩增产物越多,与SYBR-Green结合越多,荧光信号也就越强。通过释放出的荧光值来进行检测,可以对任何目的基因定量,此方法不需要合成高价的探针,而只需要通过设计并合成特异性强的引物,增强其特异性,达到检测的目的。本课题第二部分建立了SYBR-Green荧光定量PCR方法,检测由肠道病毒EV71引发的手足口病。针对其保守区域VP1基因,通过软件ABI primer Express2.0软件设计引物,目的片段为88bp,用第一部分所构建的亚克隆质粒,作为阳性模板建立SYBR-Green荧光定量PCR标准曲线及阳性对照,并做重复性试验,及方法特异性的实验评价。成功构建的SYBR-Green荧光定量PCR标准曲线：Y=-3.01x+36.95,R2为0.994,平均试验间变异系数0.945%。分别用30例手足口病的粪便样本及30例正常人粪便样本对此方法进行验证,并与逆转录PCR检测结果相比较。寡核苷酸基因检测芯片具有高度的特异性和灵敏性,由于寡核苷酸芯片固定的探针为特定的DNA寡核苷酸片段,众多基因在同一张芯片上杂交,杂交条件统一,并经过优化,可防止扩增失败对实验的影响。选择60mer长度的寡核苷酸探针,可取得特异性及敏感度的平衡。基于以上特点,本研究运用寡核苷酸基因检测芯片进行检测。本课题的第三部分,以近年来在中国地区爆发较多的肠道病毒EV71的C4亚型基因组(登录号：FJ360544)作为研究对象。经分析整个基因组有一个开放阅读框,编码含2194个氨基酸的多聚蛋白,其两侧为5’端和3’端的非编码区域。肠道病毒EV71编码4个结构蛋白和7个非结构蛋白。将肠道病毒EV71的基因组全长序列,分别与序列相似的的脊髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒、埃可病毒进行BLAST比对,根据比对结果剔除同源性高的区域,使用软件Allele ID6.0对同源性<40分的区段进行二次或者三次比对,分析得到结构蛋白VP4(VP4基因)、结构蛋白VP2(VP2基因)、结构蛋白VP3(VP3基因)、结构蛋白VP1(VP1基因)作为设计寡核苷酸探针的备选序列。运用生物学软件Array Designer4.2对特异性的序列进行分析,设计出长度均一,各种长度合适的探针20条。阳性对照是标记中通用引物的重复序列,阴性对照是与肠道病毒EV71没有同源性的水稻基因序列,并包括空白对照。以第一部分中VP4、VP2、VP3、VP1基因的亚克隆,作为阳性质粒,对寡核苷酸探针进行筛选；同时对也能引起手足口病的柯萨奇A组病毒16型质粒进行RD荧光标记杂交,检测探针的特异性。根据荧光信号值、信噪比,最终筛选出符合要求的高特异性和高灵敏度的寡核苷酸探针14条,即：1、2(针对VP4基因)；4、6、7(针对VP2基因)；9、10、12(针对VP3基因)；13、14、16、17、19、20(针对VP1基因)。肠道病毒EV71寡核苷酸的制备,为进一步建立多肠道病毒的联合检测芯片打下实验基础。综上所述,本研究通过NCBI进行比对分析,建立了肠道病毒EV71的cDNA亚克隆,其中包括保守区域VP4基因、VP2基因、VP3基因和VP1基因。根据国际上分型的基因VP1,建立了SYBR-Green荧光定量PCR方法,进一步对肠道病毒EV71进行定量分析。并根据生物学软件对保守区域设计寡核苷酸检测芯片,经过实验操作,对其进行优化,筛选出14条符合条件的高特异性探针,为多个基因联合检测芯片打下基础。该研究对肠道病毒EV71在临床上进行早期治疗诊断方面具有重要意义。