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热应激对动物健康和生殖功能均有明显的负面影响。哺乳动物在长期的进化过程中形成了防止生精细胞过度凋亡而导致雄性不育的机制。睾丸支持细胞生成的乳酸不仅能为各级生精细胞提供营养,还能增加生精细胞抗凋亡的能力;ERK1/2信号通路、HSP70在热应激后细胞的生存反应中发挥了重要作用。然而,热应激是否可以通过激活ERK1/2信号通路、增加HSP70的表达,促进睾丸支持细胞乳酸的生成目前还不清楚。因此,本试验以仔猪睾丸支持细胞为试验材料,43℃处理培养的支持细胞30 min,通过添加信号通路的抑制剂和RNA干涉技术,探索磷酸化ERK1/2在热诱导的乳酸合成中的作用,以及磷酸化ERK1/2与HSP70表达之间的关系。本试验以21日龄的仔猪睾丸为试验材料,通过43℃培养箱处理睾丸支持细胞30 min模拟热应激环境,然后在32℃培养箱恢复不同时间(0,1,2,4,6 h)。采用CCK-8试剂盒检测细胞的活率;利用定量PCR检测乳酸生成相关基因的表达,运用western blotting检测细胞中ERK1/2的磷酸化水平和乳酸分泌相关蛋白的表达,收集细胞和培养液用乳酸检测试剂盒进行乳酸分泌量的测定。根据已确定的恢复时间,用U0126(ERK1/2信号通路抑制剂,处理2 h)和RNA干涉片段(处理6 h)处理细胞,分析HSP70、GLUT3和LDH A表达情况以及LDH活性及乳酸合成量。试验结果如下:(1)热处理结束后6 h内,ERK1/2磷酸化水平均高于对照,但呈逐渐下降的趋势,第4 h开始,已经与对照组并无显著差异(P>0.05);HSP70蛋白表达和乳酸合成量在6 h内则呈现逐渐升高的趋势(P<0.01),综合考虑ERK1/2、HSP70蛋白表达和乳酸合成量,在后续试验中选择2 h作为热应激后的恢复时间。(2)不同浓度的U0126对细胞的存活率均有一定的影响,随着其浓度的升高,细胞活性逐渐降低;当浓度为5μM时,与对照组相比差异显著(P<0.01);1μM处能够显著抑制细胞内ERK1/2信号通路的激活(P<0.01),但对细胞活性无显著影响(P>0.05)。(3)合成的ERK1 siRNA对ERK1 mRNA表达无显著抑制作用(P>0.05),而ERK2 siRNA显著抑制ERK2 mRNA表达(P<0.01)。因此选择ERK2 siRNA来进行后续试验。(4)与对照组相比,热应激可以显著促进HSP70、GLUT3和LDH A的蛋白和mRNA水平的表达,增强LDH活性以及增加乳酸合成;在热应激处理之前,对细胞进行U0126和ERK2 si RNA预处理,都显著抑制了热应激诱导的上述变化。总之,热应激通过激活ERK1/2信号通路,进而增加HSP70表达,HSP70则通过上调GLUT3和LDH A的表达,促进乳酸合成。本研究揭示了ERK1/2在热应激调节仔猪睾丸支持细胞乳酸合成过程中的作用机制,为将ERK1/2促进剂和下游的HSP70应用于临床实践,缓解热应激带来的雄性生殖功能损伤提供了临床前的证据。