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背景:豆蔻酰化的富含丙氨酸C激酶底物蛋白1（Myristoylated alanine-rich C-kinase substrate like 1,MARCKSL1）,属于 MARCKS 家族成员。MARCKSL1 被蛋白激酶磷酸化后,失去与细胞质膜的亲和力,游离到细胞质中,参与调控细胞侵袭、迁移以及多种信号转导。已有研究表明,MARCKSL1在神经系统发育、血管生成等生命活动中,调控有丝分裂、整合素激活、细胞粘附调控、细胞吞噬、粘蛋白分泌等生理过程。并且MARCKSL1与多种肿瘤细胞增殖、迁移、侵袭等过程相关,MARCKSL1缺失会造成小鼠颅骨发育异常,神经管闭合缺陷,导致小鼠胚胎期死亡。目前已知MARCKSL1在机体生长发育与细胞迁移分化中发挥了重要作用,但MARCKSL1在造血系统和血液相关疾病中的功能尚不清楚。本项目旨在探究MARCKSL1在K562细胞以及小鼠造血干细胞中的调控作用。方法:本课题首先通过分析MARCKSL1在白血病人中的表达水平以及与白血病人生存率的关系初步推测该基因在白血病进展中的作用。随后分别利用CRISPR/Cas9技术在人慢性髓细胞白血病细胞系K562细胞中敲除MARCKSL1基因,以及构建MARCKSL1表达载体建立MARCKSL1过表达K562稳转细胞系。通过免疫荧光技术首先确定MARCKSL1的表达位置,随后探究MARCKSL1在K562细胞迁移,增殖以及凋亡等过程中的调控作用。利用蛋白免疫印迹分析细胞凋亡信号通路相关蛋白的表达水平变化情况。并且通过蛋白质谱、免疫共沉淀筛选MARCKSL1的互作蛋白,构建Myc-YWHAZ,Myc-XPO1质粒,利用Flag以及Myc作为报告基因检测与MARCKSL1发生直接相互作用的蛋白,确定MARCKSL1过表达诱导K562细胞凋亡的具体分子机制。此外,通过移植瘤实验评估MARCKSL1过表达在体内对K562细胞成瘤的影响。结合超声分析,HE染色以及TUNEL染色分析肿瘤内部的血液供应能力,病理变化和细胞凋亡情况。此外,本实验利用CRISPR/Cas9技术构建MARCKSL1基因敲除小鼠,通过血常规分析血细胞的数量比例变化,流式细胞术分析E15.5天胎肝的造血干细胞变化,分别将E15.5天M4RCKSL1基因敲除以及野生型小鼠的胎肝通过移植实验分析MARCKSL1基因缺失对造血重建能力的影响。结果:1.与正常对照人群相比,MARCKSL1在慢性髓细胞白血病中表达量较高,但在急性白血病中无明显差异,并且MARCKSL1的表达水平与白血病人的存活时间呈正相关。2.通过对不同人组织来源的细胞系分析,发现MARCKSL1在K562细胞中具有较高的表达水平。针对MARCKSL1基因打靶,总共获得124个细胞克隆,其中sgRNA-Al/sgRNA-B1靶点46个细胞克隆,基因编辑效率为78%;sgRNA-A2/sgRNA-B2靶点78个细胞克隆,基因编辑效率为83%,但结果显示只获得敲除杂合子,没有MARCKSL1敲除纯合子。3.通过建立MARCKSL1稳转细胞系,发现MARCKSL1主要定位分布于细胞质与细胞膜。与空载体对照相比,MARCKSL1过表达延缓K562细胞增殖,增强细胞迁移能力,导致凋亡细胞比例上升。凋亡相关信号蛋白Caspase8/Caspase3激活,免疫共沉淀结果表明XPO1是MARCKSL1直接互作蛋白。异种肿瘤移植实验结果表明MARCKSL1过表达抑制肿瘤生长,并通过超声影像显示其内部的血量丰富程度降低,血液供应能力减弱。HE染色结果显示MARCKSL1过表达组的肿瘤细胞更加疏松,变性液泡更大,核仁不明显,处于分裂期的细胞减少。肿瘤中凋亡相关蛋白Caspase8/Caspase3受到激活,肿瘤组织的TUNEL染色结果也显示MARCKSL1过表达组的肿瘤细胞凋亡数量较多。4.MARCKSL1基因缺失造成的小鼠死亡主要发生于胚胎发育后期。并且,与野生型小鼠相比,MARCKSL1基因敲除小鼠E15.5天胎肝中的造血干细胞数量占比增多。胎肝移植后4、8、12、16周的外周血流式分析显示,与野生型相比,基因敲除小鼠中的B淋巴细胞、造血干细胞、共同的髓系祖细胞以及淋巴祖细胞数量减少,髓系细胞和粒系-单核系祖细胞数量增多。结论:1.MARCKSL1在CML病人中高表达,且其表达量与白血病病人生存时间呈正相关,提示MARCKSL1在CML的病理进程中可能发挥重要功能。2.MARCKSL1对于人慢性髓细胞白血病K562细胞存活至关重要,MARCKSL1过表达导致K562细胞迁移能力增强,促进细胞衰老,诱导细胞凋亡并延缓细胞增殖。并且,MARCKSL1过表达在体内具有抑制K562细胞移植瘤实验中肿瘤生长的作用,主要是通过激活XPO1/Caspase8/Caspase3介导凋亡途径来实现的。3.MARCKSL1缺失会导致敲除小鼠胎肝造血干细胞数量升高,并影响胎肝造血干细胞的造血重建能力,导致谱系分化由淋系向髓系分化偏移。