细胞凋亡(apoptosis)，是细胞在一系列内源性基因的调控下发生的自然或生理性死亡过程。细胞凋亡过程阻滞与细胞增殖异常一样，是肿瘤发生的主要机制之一。因而，肿瘤细胞凋亡是肿瘤研究发展的新领域，寻找高效低毒的能诱导肿瘤细胞凋亡的药物有可能成为肿瘤治疗的新热点。 叶酸(folic acid，folate，FA)是一种水溶性B族维生素，参与腺嘌呤、鸟嘌呤及胸腺嘧啶的合成以及DNA、tRNA复合物等多种蛋白质的合成，同时叶酸又是多种氨基酸转换酶和多种维生素转换过程中的主要底物之一，其辅酶形式是四氢叶酸，在酶促反应中参与一碳单位的转移。因而，叶酸在细胞代谢和细胞增殖分化中起重要作用。叶酸缺乏可以引起DNA损伤、不稳定及甲基化异常，这些变化均可引起肿瘤的发生。研究表明，叶酸对肿瘤细胞有诱导凋亡作用。饮食中缺乏叶酸与结直肠肿瘤发生的高危险性有相关关系，在饮食中补充叶酸可以起到化学预防作用，而且叶酸的细胞保护作用可能有剂量依赖性。 大肠癌是常见的恶性肿瘤之一，近年发病率迅速增长。我国大肠癌的发病率已从30年前的10/10~5上升到现在的30/10~5，在恶性肿瘤的排名中，从第6位上升到第3、4位。有大量的临床流行病学及临床干预实验表明，叶酸在结直肠肿瘤发生中有化学性预防作用，但叶酸的确切作用机制仍不十分明确。本课题采用体外细胞培养人结肠癌细胞株HCT一8，通过观察叶酸对HCT一8细胞增殖及凋亡的影响，用MTT方法选择接近ICS。的浓度来诱导细胞凋亡。运用免疫组化、原位杂交以及琼脂糖凝胶电泳分析DNA变化等方法观察叶酸诱导HCT一8细胞的凋亡，并探讨其诱导细胞凋亡的机制，从而为叶酸用于肿瘤的预防性干预治疗提供理论依据。方法 1.不同浓度的叶酸处理体外培养的HCT一8细胞72h后，用Ml，T方法测定叶酸对结肠癌细胞的生长抑制率，选择50 pg/m1浓度的叶酸来研究细胞凋亡。 2.叶酸诱导凋亡的检测 取对数生长期的HcT一8细胞，细胞浓度调整至7 x 1 04/ml，接种于25而的培养瓶中，24h后随机分组，分别为叶酸实验组和对照组，每组5瓶，对照组加入不含叶酸的完全培养液。 2.1.用原位杂交方法，检测50pg/inl叶酸作用 72h后实验组与对照组细胞凋亡调控基因bcl-2及bax的mRNA表达的变化。 2.2，用免疫组化sP法，检测50 p g/ml叶酸作用72h后实验组与对照组细胞凋亡调控基因Bcl-2及刀以蛋白表达的变化。 2.3.叶酸组分别加入50“g/ml和100pg/ml的含药物培养液，对照组加入完全培养基。用酚和氯仿提取DNA技术，提取叶酸作用72h后实验组与对照组细胞的DNA，琼脂糖凝胶电泳分析DNA断裂的情况。结果 1.MTT结果显示，不同浓度的叶酸对HCT一8细胞作用72h后，细胞生长和增殖受到不同程度的抑制。随叶酸浓度的增加，叶酸对HCT一8细胞生长的抑制作用逐渐郑州大学硕士学位论文(2003届)叶酸诱导人结肠癌细胞株凋亡的实验研究增加，5 pg/ml、lopg/ml、Zopg/ml、sopg/ml、100协岁血1、Zoopg/inl的抑制率分别为7.4%、20.4%、28.5%、41.7%、67.7%、73.1%。 2.原位杂交检测bcl-肠ax的mRNA的结果显示，50协留ml的叶酸作用于HCT一8细胞72h后，细胞内凋亡调控基因bcl-2的mRNA阳性率明显减少(0.582士0.049)，bax的mRNA阳性率明显增加(0.582士0.045)，与对照组相比差异均有统计学意义 (P(0.05)。 3.免疫组化SP法结果显示，50p留ml的叶酸作用HCT-8细胞72h后，凋亡调控基因bcl-2的蛋白阳性表达率明显降低(0.566士0.059)，bax基因的蛋白阳性表达率明显增高(0.557士0.035)，与对照组相比差异均有统计学意义(P<0 .05)。 4.DNA抽提及琼脂糖凝胶电泳结果提示，50p岁nil及loop岁ml的叶酸诱导细胞凋亡时，可以出现明显的DNA“梯状”断裂条带，而对照组无此现象。结论 1.FA可以抑制人结肠癌细胞株HCT一8的生长，随着叶酸浓度的增加，对细胞生长的抑制作用明显增强;对于不同的肿瘤细胞来说，FA的最适剂量各不相同。2.本研究结果提示，叶酸作用HCT-8后bel一2的mRNA和蛋白表达明显降低，而bax的mRNA和蛋白表达明显增高，琼脂糖凝胶电泳可出现凋亡“梯状”DNA条3.FA可望作为诱导肿瘤细胞凋亡的抗肿瘤药物应用于肿瘤的预防性化学治疗。