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重组人促红细胞生成素(rhEPO)是最早用于临床的重组基因工程药物之一,目前已广泛用于各种贫血患者的治疗,包括肾性贫血、肿瘤放、化疗所致的贫血等,但由于其半衰期较短,需要频繁给药,从而限制了其临床应用。长效重组人促红细胞生成素融合蛋白rhEPO-Fc是由rhEPO与IgG的Fc片段融合而成,这种新型的rhEPO-Fc融合蛋白表现为血浆半衰期延长,生物活性增加,因此在治疗贫血时可以减少用药量并减少注射的频率。本研究采用C57小鼠γ-辐射后骨髓抑制性贫血模型、SD大鼠肾切除后肾性贫血模型、及猕猴环磷酰胺所致骨髓抑制性贫血模型,研究rhEPO-Fc对动物不同贫血模型的长效治疗作用及量效关系,并确定rhEPO-Fc长期使用是否会产生抗体。同时在整体动物实验基础上进行体外研究,采用人骨髓来源的UT-7/EPO细胞株,用CCK-8、流式细胞仪、光镜、透射电镜等方法观察rhEPO-Fc抑制γ-射线辐射诱导UT-7/EPO细胞凋亡的作用,用免疫荧光、western blotting等技术研究rhEPO-Fc抑制γ-射线辐射诱导UT-7/EPO细胞凋亡时凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax及caspase3表达水平的变化,以探讨rhEPO-Fc抑制γ-射线辐射所诱导UT-7/EPO细胞凋亡的分子机制。第一部分rhEPO-Fc对不同动物贫血模型治疗作用的研究1 rhEPO-Fc对γ辐射所致C57小鼠骨髓抑制性贫血的影响C57小鼠70只,经137Csγ-射线4Gy单次全身辐射,造成骨髓抑制性贫血,于辐射前及辐射后不同时间采血,测定红细胞计数、血红蛋白量、红细胞压积及网织红细胞计数等,小鼠随机分为5组,分别为溶媒对照组,rhEPO-Fc 3个剂量组(剂量分别为7.5,15,30μg·kg-1,每周给药1次)和rhEPO组(阳性对照组,剂量为7.5μg·kg-1,每周给药3次),均为皮下注射给药,连续给药25天,停药后观察5天。结果显示rhEPO组每周3次、rhEPO-Fc 7.5,15,30μg·kg-1组每周1次皮下注射,C57小鼠红细胞计数、血红蛋白量、红细胞压积从给药后第11天到25天与溶媒对照组比较明显升高(p<0.01),rhEPO-Fc 30μg·kg-1组每周1次皮下注射,C57小鼠从给药后第7天开始到停药后5天,rhEPO组每周3次皮下注射,C57小鼠在药后第18及25天网织红细胞计数均明显升高,与溶媒对照组比较差别有显著意义(p<0.01)。rhEPO-Fc 7.5,15,30μg·kg-1组每周1次皮下注射,C57小鼠脾脏重量和脾脏系数与对照组比较无明显差异(p>0.05)。其中rhEPO-Fc 7.5,15,30μg·kg-1三个剂量组在升高红细胞计数、血红蛋白量、红细胞压积及网织红细胞计数时呈现剂量依赖性。结果提示rhEPO-Fc能有效治疗γ-辐射所致C57小鼠骨髓抑制性贫血,rhEPO-Fc 15、30μg·kg-1每周1次皮下注射疗效与rhEPO 7.5μg·kg-1每周3次皮下注射疗效相似,而且rhEPO-Fc 7.5、15、30μg·kg-1三个剂量组之间存在剂量依赖关系。2 rhEPO-Fc对部分肾切除所致SD大鼠肾性贫血的影响SD大鼠70只,经2次手术后切除5/6肾脏,造成肾性贫血模型,于肾切除前及切除后不同时间采血,测定红细胞计数、血红蛋白量、红细胞压积、网织红细胞计数及血尿素氮等。SD大鼠随机分为6组,分别为模型组、假手术组、rhEPO-Fc3个剂量组(剂量分别为5.4、10.7、21.4μg·kg-1,每周1次给药)和rhEPO组(阳性对照组,剂量为5.4μg·kg-1,每周3次给药),均为皮下注射,连续用药4周,停药后观察2周。结果显示rhEPO组(药后第1周到停药后1周)、rhEPO-Fc5.4μg·kg-1组(药后第1周到药后第2周)、10.7μg·kg-1组(药后第1周到药后第4周)、21.4μg·kg-1组(药后第1周到停药后2周)红细胞计数、血红蛋白量、红细胞压积及网织红细胞计数(用药后1周)与模型组比较明显升高,差别有显著意义(p<0.01)。肾切除后的模型组、rhEPO-Fc5.4、10.7、21.4μg·kg-1组及rhEPO组血尿素氮在整个实验过程中均维持在较高水平,与假手术组比较,差异均有显著意义(P<0.01)。其中rhEPO-Fc 5.4、10.7、21.4μg·kg-1三个剂量组在治疗部分肾切除所致SD大鼠肾性贫血时呈现剂量依赖关系。结果提示rhEPO-Fc能有效治疗部分肾切除所致SD大鼠肾性贫血,rhEPO-Fc 10.7、21.4μg·kg-1每周1次与rhEPO5.4μg·kg-1每周3次皮下注射疗效相似,而且rhEPO-Fc5.4、10.7、21.4μg·kg-1三个剂量组之间存在剂量依赖关系。3 rhEPO-Fc对环磷酰胺所致猕猴骨髓抑制性贫血的影响猕猴16只(雌9雄7),静脉注射环磷酰胺50mg·kg-1×2天造成骨髓抑制,在用环磷酰胺前及以后不同时间采血,测定红细胞计数、血红蛋白量、红细胞压积、网织红细胞计数、白细胞计数及血小板计数等。猕猴分为4组,每组4只,分别为溶媒对照组、2个rhEPO-Fc治疗组(剂量分别为5、10μg·kg-1,每周1次给药)、rhEPO组(剂量为2.5μg·kg-1,每周3次给药),均为皮下注射,连续用药49天,停药后观察35天。结果显示rhEPO组、rhEPO-Fc10μg·kg-1组药后42及49天猕猴红细胞计数、红细胞压积、血红蛋白量(药后35天到49天)、网织红细胞计数(药后49天)与溶媒对照组比较明显升高,差别有显著意义(p<0.01)。rhEPO组、rhEPO-Fc10μg·kg-1组从药后第28天到停药后21天猕猴红细胞计数、血红蛋白量(药后第28天到停药后14天)、红细胞压积(药后第28天到药后49天)、网织红细胞计数(药后49天)与实验前比较明显升高,差别有显著意义(p<0.01)。rhEPO-Fc5μg·kg-1组(药后第12及14天)、rhEPO-Fc 10μg·kg-1组(药后第14、16、42天)猕猴血小板明显升高,与溶媒对照组比较差别有显著意义(p<0.05)；rhEPO组、rhEPO-Fc5、10μg·kg-1组猕猴的外周血白细胞计数在整个实验过程中与溶媒对照组及实验前比较,差别无显著意义(p>0.05)。结果提示皮下注射rhEPO-Fc能有效治疗由环磷酰胺所致猕猴骨髓抑制性贫血,rhEPO-Fc10μg·kg-1每周1次与rhEPO2.5μg·kg-1每周3次皮下注射疗效相似。4 Elisa法检测猕猴rhEPO-Fc抗体用药前各只猕猴血清中均未检测到抗体,并且rhEPO-Fc小、大剂量(5μg·kg-1、10μg·kg-1,1次·周-1sc.)在连续使用49天及停药后35天内均未检测到rhEPO-Fc抗体；而rhEPO组一只猕猴用药后12天开始产生rhEPO抗体,直至停药后21天血清中仍有抗体存在。提示rhEPO-Fc与rhEPO不同,长期使用不易产生抗体。第二部分rhEPO-Fc抑制γ-辐射诱导UT-7/EPO细胞凋亡的作用及机制研究1 rhEPO-Fc抑制γ-辐射诱导UT-7/EPO细胞凋亡的作用UT-7/EPO细胞用8Gyγ-射线照射后,用细胞因子治疗或不治疗,并把细胞分为5组：对照组(不加rhEPO)、rhEPO-Fc 0.7U/ml组、rhEPO-Fc 7U/ml组、rhEPO-Fc 70U/ml组、rhEPO 7U/ml组。各组细胞用CCK-8、流式细胞仪、光镜、透射电镜等方法观察rhEPO-Fc抑制γ-射线辐射诱导UT-7/EPO细胞凋亡的作用。结果显示γ-辐射后分别给予rhEPO-Fc 0.7、7、70U/ml及rhEPO 7U/ml能显著提高UT-7/EPO细胞存活率,明显抑制凋亡率,在24h、48h、72h与辐射对照组细胞比较有显著性差异；且rhEPO-Fc 0.7、7、70U/ml及rhEPO 7U/ml明显减少γ-辐射后G0/G1期细胞数,增加G2/M期、S期的细胞数,在24h与辐射对照组比较有显著性差异；细胞形态学观察可见γ-辐射后的UT-7/EPO细胞体积变小,核碎裂,核染色质浓缩,聚集于周边形成新月状,呈现出细胞凋亡典型的变化,γ-辐射后分别给予rhEPO-Fc 0.7、7、70U/ml及rhEPO 7U/ml的UT-7/EPO细胞表现出正常形态,未见凋亡典型特征。结果提示rhEPO-Fc 0.7、7、70U/ml可抑制γ-射线辐射诱导UT-7/EPO细胞凋亡2 rhEPO-Fc抑制γ-辐射诱导UT-7/EPO细胞凋亡的机制经不同处理的各组UT-7/EPO细胞用免疫荧光及western blotting技术观察凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax及caspase 3表达。免疫荧光结果显示UT-7/EPO细胞γ-辐射后24h抗凋亡蛋白Bcl-2表达较弱,γ-辐射后分别给予rhEPO-Fc0.7、7、70U/ml及rhEPO 7U/ml则Bcl-2表达增强,各组细胞促凋亡蛋白Bax表达未见差异。western blotting结果显示γ-辐射后24h及48h的UT-7/EPO细胞,抗凋亡蛋白Bcl-2表达基本消失,相对Bcl-2/Bax蛋白比值较低,caspase 3前体(pro-caspase 3)表达较弱,caspase 3活性片段p17和p12被诱导；而γ-辐射后分别给予rhEPO-Fc0.7、7、70U/ml,及rhEPO 7U/ml,与辐射对照组比较,抗凋亡蛋白Bcl-2表达增强,Bcl-2/Bax蛋白比值与辐射对照组比较明显增加(p<0.01),caspase 3的表达也与正常培养的细胞接近,未见活性片段被诱导,促凋亡蛋白Bax的表达在各组细胞之间无显著差异。结果提示rhEPO-Fc可能通过增加抗凋亡蛋白Bcl-2的表达、增加Bcl-2/Bax蛋白比值及抑制caspase 3的激活而对抗γ-辐射所诱导的UT-7/EPO细胞凋亡。结论：1. rhEPO-Fc每周1次皮下注射在纠正γ-辐射所导致的C57小鼠骨髓抑制性贫血、5/6肾切除所导致的SD大鼠肾性贫血及环磷酰胺所诱导的猕猴骨髓抑制性贫血时与rhEPO每周3次皮下注射等效。2. rhEPO-Fc每周1次皮下注射,在连续使用49天及停药后35天内未检测到猕猴血清中抗rhEPO-Fc抗体。3. rhEPO-Fc可能通过增加抗凋亡蛋白Bcl-2的表达、增加Bcl-2/Bax蛋白比值及抑制caspase 3的激活而对抗γ-辐射所诱导的UT-7/EPO细胞凋亡