论文部分内容阅读
炭疽(Anthrax)是由炭疽杆菌(Bacillus anthracis)引起的一种传染性疾病,炭疽杆菌为需氧性革兰氏阳性芽孢杆菌,美英等许多国家都将其列为级别最高的传染病。炭疽之所以如此恐怖,其原因不在于细菌本身,而在于炭疽杆菌释放的炭疽毒素,事实上炭疽杆菌对大多数抗生素敏感,常规抗生素如青霉素、环丙沙星及多西环素等均可以将其杀死。炭疽感染从细菌入侵到病症出现往往有5-7天的潜伏期,这期间炭疽杆菌往往在体内大肆繁殖,并释放大量毒素,虽然潜伏期过后抗生素治疗仍可以杀死体内的炭疽杆菌,但此时炭疽杆菌释放的大量炭疽毒素则早已超过人体生命承受范围,这也就是炭疽杆菌比其它细菌可怕的主要原因。编码炭疽毒素的基因位于炭疽杆菌的pX01质粒,该质粒编码的毒素蛋白由三部分组成,即保护性抗原(protective antigen,PA)、致死因子(lethal factor, LF)和水肿因子(edema factor,EF)。其中PA是介导毒素进入细胞的主要因子,当PA与靶细胞膜上的PA受体(TEM8和CMG2)结合后,PA和PA受体形成七聚体结构,并介导LF或EF进入靶细胞,从而损伤靶细胞结构功能以及靶器官生理功能。因此,设计能有效阻止PA和PA受体结合的分子,是抵抗炭疽毒素入侵损伤细胞和器官的有效手段。本研究根据炭疽毒素入侵细胞机制,分别设计了PA第四结构域(596-735aa,为PA结合其受体的结构域)与人IgG1 Fc段融合蛋白(本论文中简写为PA4-Fc)、TEM8(1-227aa,为TEM8结合PA的结构域)与Fc段融合蛋白(本论文中简写为TEM8-Fc)和CMG2(1-225aa,为CMG2结合PA的结构域)与Fc段融合蛋白(本论文中简写为CMG2-Fc)。相比其它PA抗体类分子,本研究设计分子理论上有以下特点:1、CMG2和TEM8为人体内的天然生理分子,不存在免疫原性问题。2、通过融合人IgG Fc片段,可延长其在体内的半衰期,增加生物学活性并减少用药剂量和次数。3、当CMG2和TEM8结合炭疽杆菌PA后,可通过Fc片段和APC细胞膜上Fc受体结合,加快机体吞噬细胞对PA的“识别摄取”速度。4、和PA单克隆抗体相比,诱捕性CMG2和TEM8分子可避免由于炭疽杆菌PA突变所造成的抗体不识别效应(如PA突变体PA83 K684A、L685A、L687A和Y688A不能被PA单克隆抗体14B7识别,但其仍能够介导炭疽毒素进入损伤细胞)。5、由于含有Fc标签,可通过Protein A亲和柱对表达蛋白进行纯化,减少纯化步骤。通过常规分子克隆技术,本研究获得了PA4-Fc、CMG2-Fc和TEM8-Fc分子的基因表达载体,通过转染CHO-K1细胞和G418加压单克隆筛选,获得了表达三种蛋白的细胞株,ELISA结果显示三种蛋白在CHO细胞中都有较高的表达(表达量约20-30mg/L)。通过转瓶无血清培养方法共获得约400mg蛋白(其中PA4-Fc 120mg,TEM8-Fc 180mg,CMG2-Fc 100mg)。还原和非还原蛋白电泳显示CMG2-Fc和TEM8-Fc蛋白为单一条带,质谱方法测定CMG2-Fc蛋白分子量约95.4kDa,而TEM8-Fc蛋白分子量为111.5kDa,蛋白大小和实验预期一致。在对PA4-Fc蛋白的电泳检测中,结果呈现为三条带,为排除糖基化不均一对蛋白大小造成的影响,对PA4-Fc蛋白进行了去糖基化后电泳鉴定,结果显示三条带并非由糖基化问题所致。Western-Blotting检测表明PA4-Fc是在表达到胞外过程中发生降解,本研究通过添加蛋白酶抑制剂及更换宿主细胞,结果显示转染BHK-21宿主细胞可降低PA4-Fc的降解,但却造成PA4-Fc的糖基化不均一。本研究通过ELISA、GST pull down等方法检测了三种蛋白结合各自配体/受体的能力,实验结果证明CMG2-Fc和TEM8-Fc均能够很好的结合其配体PA。此外,通过BIA2000和fortéBio QK测定三种蛋白和相应受体/配体的亲和力,结果显示三种蛋白和相应配体/受体的亲和力KD值均在10-8 mol/L以上,CMG2-Fc和PA的亲和力KD值达到1.31×10-11 mol/L,远高于TEM8-Fc(3.26×10-8mol/L),与Heather M. Scobie等报道的CMG2亲和力(KD=7.8 nM)相比高出近一倍,其原因可能为本研究构建的CMG2-Fc为二聚体结构,其结合PA的能力要比单体CMG2高。而当前报道的针对PA的单克隆抗体和PA的亲和力多在nmol/L水平,这显示出CMG2作为PA的诱捕分子和单克隆抗体相比具有一定的结合优势。体外细胞保护实验中,本研究选用小鼠巨噬细胞RAW264.7和J774A.1检测三种蛋白抗毒素效果。结果显示CMG2-Fc和TEM8-Fc均能有效抑制炭疽毒素对小鼠巨噬细胞的攻击,其中CMG2-Fc的保护效果要好于TEM8-Fc(IC50分别为0.49 nmol/L和500 nmol/L),与ELISA及亲和力检测结果一致,表明三种检测方法具有一定的正相关性。本研究构建的另外一个分子PA4-Fc却不能拮抗炭疽毒素所造成的损伤效应,可能是因为巨噬细胞膜表面PA受体较多,而PA4-Fc又较野生型PA结合PA受体的能力弱,故PA4-Fc不能够完全竞争性抑制野生型PA与PA受体结合,而只要有少量炭疽毒素进入细胞,就可以将细胞杀死。动物体内保护实验中,本研究选用Fisher 344大鼠检测CMG2-Fc保护效果,将二者混合(Mol CMG2-Fc﹕Mol LeTx=2﹕1)并进行尾静脉注射,结果证明CMG2-Fc蛋白组大鼠在24小时内均未出现任何异常表现和死亡,而仅注射炭疽毒素组大鼠在60±15min内均全部死亡,这表明CMG2-Fc具有中和炭疽毒素攻击F344大鼠的能力,亦显示出CMG2-Fc作为抗炭疽毒素药物具有进一步研究和开发的潜力。此外,本研究还通过大耳白兔动物免疫比较了PA4-Fc和完整PA的免疫原性,并通过BALB/c小鼠免疫检测了Fc片段对PA4免疫原性的影响。细胞保护实验显示PA4-Fc免疫血清、完整PA免疫血清及单独PA4免疫血清均能够拮抗炭疽毒素对小鼠巨噬细胞的损伤,但PA4-Fc免疫血清的保护效果弱于PA免疫血清(IC50分别为1/22和1/53)和PA4(IC50分别为1/57和1/170)。其原因可能是由于PA4-Fc抗血清仅仅封闭PA和受体结合的结构域,而完整PA抗血清不仅封闭了PA和受体结合的结构域,而且还可能封闭了PA自我组装结构域以及PA和LF/EF结合的位点等。为进一步增强CMG2-Fc结合PA的能力,本研究根据有关CMG2和PA结合结构域报道,通过计算机软件模拟分析构建了CMG2(N57L),CMG2(E117Q),CMG2(T118K),CMG2(Y119Q),CMG2(H121E),CMG2(K125E),CMG2(D148K),CMG2(Y158Q)八个突变体。此外,为观察CMG2胞外区二硫键(C38-C218)对CMG2结合PA的影响,本研究还构建了无胞外区二硫键的CMG2(1-217aa)-Fc剪短体分子,并通过哺乳动物细胞表达获得了上述九种蛋白。细胞保护实验和亲和力检测显示E117Q突变能增强CMG2-Fc和PA的亲和力并能更有效抵抗炭疽毒素攻击(IC50为0.15 nM),而T118K、H121E和D148K突变则严重降低CMG2-Fc结合PA和中和炭疽毒素的能力,提示这些位点对于CMG2结合PA具有重要作用。另外,去除胞外区二硫键的CMG2(1-217aa)-Fc相比CMG2-Fc蛋白分子,其中和炭疽毒素能力仅为CMG2-Fc的1/40(IC50分别为0.49 nM和20nM),提示CMG2胞外区二硫键对于维持CMG2胞外区结构和结合PA具有重要作用。