目的:本研究通过提取中药方剂龟板散组分中促进皮肤愈合的单体成分,包括龟板的有效单体S8、黄连的有效单体盐酸小檗碱和冰片的有效单体右旋龙脑,制成龟板软膏(Tortoise Shell Ointment,TSO),作用于大鼠急性皮肤创面,观察TSO对大鼠急性皮肤创面的修复效果,探讨TSO是否可通过调控毛囊干细胞(Hair Follicle stem cells,HFSCs)的Wnt/β-catenin信号通路,促进HFSCs增殖,加快急性皮肤创面的修复,为基于中药有效单体成分治疗皮肤创面的新药研究提供思路。方法:1.取龟板的有效单体S8、臣药黄连的有效单体盐酸小檗碱及佐使药冰片中的有效单体右旋龙脑进行成分配伍与剂型改良,按照不同剂量制备成低、中、高剂量的TSO;通过将TSO作用于SD大鼠急性皮肤创面,进行实验最佳剂量的筛选;通过外观性状观察、稳定性试验、皮肤刺激性试验对TSO进行质量检测。2.制作SD大鼠急性皮肤创面模型,造模后连续3天注射BrdU(50mg/kg)标记增殖细胞。将大鼠分为五个药物组:TSO组、京万红(JWH)组、S8组、盐酸小檗碱(BBR)组、空白对照(NS)组。TSO组予以TSO外涂(厚度为1-2mm),JWH组予以京万红软膏外涂(厚度为1-2 mm),S8组予以S8溶液,BBR组予以盐酸小檗碱溶液,NS组予以生理盐水。每日给药2次,连续给药10天。各组分别于修复第3d、5d、7d、10d取材,进行创面大体观察,对各组大鼠的创面修复情况进行评分,计算创面愈合率,进行HE染色和MASSON染色,评估皮肤创面修复效果。3.采用免疫荧光和Western blot法检测Wnt/β-catenin信号通路的β-catenin、LEF1、C-myc蛋白表达水平和HFSCs的标记物CD34、Integrin β1蛋白的表达情况;检测BrdU标记后大鼠创面细胞增殖的情况。成果:1.TSO由S8、盐酸小檗碱和右旋龙脑组成,药物外观色黄、质地均匀细腻、粘稠度适中、涂展性良好,对健康皮肤及破损皮肤均无明显刺激性,稳定性试验无异常。最佳剂量筛选试验得出,低剂量组促创面愈合疗效较明显,创面愈合的时间较短。2.创面修复情况大体观察显示,TSO组脱痂较其他组明显,最先出现创面愈合,创面修复时间较其他组短。第5d、7d,TSO组的创面修复情况评分优于其他组(P<0.05)。第5d、7d、10d,TSO组的创面愈合率均高于其他组(P<0.05)。3.HE染色结果显示,TSO组在第7d表皮与真皮连接紧密,皮肤附属器增多,创面基本愈合效果较其他组好;第10d,TSO组、S8组和JWH组表皮修复接近正常表皮,表皮分层明显,结构致密;BBR组见较厚表皮组织覆盖;NS组仍有少许结痂覆盖。4.Masson染色结果显示,TSO组出现胶原沉积的时间较其他组早,胶原纤维数量较其他组多,第10d,TSO组较其他组更趋向正常皮肤组织胶原纤维的特性。5.免疫荧光结果显示,β-catenin、CD34和Integrin β1主要表达于表皮棘层和基底层,LEF1和C-myc主要表达于基底层。总体而言,TSO组和S8组的β-catenin、LEF1、C-myc、CD34和Integrin β1的阳性表达强度均大于NS组。6.BrdU标记的增殖细胞免疫荧光结果显示,术后3d,TSO组和S8组BrdU标记的增殖细胞数量较NS组多,且增殖的细胞当中,出现同时表达CD34、LEF1阳性的情况。7.Western bolt 结果显示,同一时间点 TSO 组和 S8 组的β-catenin、LEF1、C-myc、CD34、Integrin β1表达水平均大于NS组。创面在修复过程中,TSO组和S8组β-catenin、CD34和Integrin β1的表达水平均呈上升趋势,LEF1和C-myc的表达水平在修复的早中期上调,在修复后期下降。三组比较,差异均具有统计学意义(P<0.05)。结论:1.所制备的TSO成分明确,制备工艺简单,质地均匀细腻、粘稠度适中、涂展性良好,具有稳定性和安全性。2.TSO可加快SD大鼠急性皮肤创面的修复,缩短创面修复的时间,其愈合效果优于单一有效单体S8和盐酸小檗碱。3.TSO可能通过调控HFSCs中的Wnt/β-catenin信号通路,促进HFSCs增殖,从而促进皮肤创面的修复,为基于中药有效单体成分治疗皮肤创面的新药研究提供思路。